毛白杨生长素信号转导因子基因的分离与功能的初步分析

论文摘要

生长素是发现最早、最经典的植物激素之一,参与调控植物的许多生长发育过程。研究生生长素信号转导有利于解释生命现象和揭示生命机理。杨属（Populus）是木本植物生物学研究的模式植物,组织培养技术成熟,具有基因组小（约500 Mbp）等特点,也是我国的优良树种。2004年毛果杨（P. trichocarpa）基因组测序已经完成。文章以毛白杨为研究对象,研究生长素信号转导因子基因在毛白杨发育过程中的作用,克隆出3个相关基因,分别命名为PtPIN1、PtIAA1和PtTIR1。同源性分析显示,PtPIN1与苜蓿MtPIN1和拟南芥的AtPIN7的同源性分别高达82%和79%;PtIAA1与拟南芥Aux/IAA家族的AtIAA16的同源性最高（70%）;PtTIR1与其他植物TIR类蛋白同源性也较高,最高的为葡萄（80%）。系统进化树分析显示PtPIN1属于生长素输出载体PIN类家族,PtIAA1属于生长素快速响应因子Aux/IAA家族的α亚族,PtTIR1属于F-box家族C4亚族的α组,编码生长素受体。为了解PtPIN1、PtIAA1和PtTIR1基因的功能,构建了它们的表达载体,并进行了PtTIR1的毛白杨和拟南芥的遗传转化。利用本实验室已构建的毛白杨生长素输入载体基因的PtAUX1表达载体,进行了拟南芥的遗传转化。RT-PCR检测PtAUX1和PtTIR1的转基因植株,分析转化植株表型和离体条件下的形态发生。超表达35::PtAUX1转拟南芥植株出现了匍匐生长,背向性实验中茎不发生90°向上弯曲。PtAUX1调节根的向地性,促进根的伸长和侧根的发生,对生长素IAA十分敏感。PtAUX1影响各器官的发育过程,普遍出现透明和增生,使表皮毛数目增多、较多的二叉分支,叶片卷曲、呈壳斗状;花器官畸形,如花萼边缘透明、卷曲、长有叶状结构、多处增生,花瓣透明、不张开、形状狭长或极短,改变了四强雄蕊的特性等,甚至有的雄蕊无花丝,花药粘状、散落困难。PtAUX1转拟南芥出现了各种形状的果实。上述结果表明PtAUX1基因通过生长素极性运输,促进各组织、细胞对内源生长素IAA的吸收,进而参与顶端分生组织的形成,影响植株形态,以及表皮毛、根、茎、叶、花和果实各器官的形态和发育过程。35S::PtTIR1转毛白杨和拟南芥的表型结果显示,PtTIR1促进植株的生长,调节植株的向光性,不改变根的向地性但促进根的伸长和侧根的发生,影响叶片的发育。转化毛白杨过程出现显著区别于野生型的芽体,如初为玉白色的花瓣状芽体后局部出现红褐色,有的芽体为透明的棒状结构,甚至无菌苗在生根培养基上出现根上长芽的情况。这些表型与PtAUX1转拟南芥的表型有许多相似处,也符合生长素的作用特点,结果说明PtTIR1通过调控生长素在植物体内的极性分布影响顶端分生组织的形成,促进植株的生长,调控向性反应,调节根和叶片的发育,可能参与了花器官的发育。这些结果初步揭示了PtAUX1和PtTIR1基因的功能,证实了生长素极性运输在植物生长发育过程中的重要作用。我们认为PtAUX1促进生长素快速响应因子PtIAA1与生长素受体SCFPtTIR1复合体结合,由PtPIN1通过囊泡调节机制将生长素IAA及时输出体外这一信号转导途径调控植物的生长发育过程。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 生长素诱导因子
• 1.1.1 生长素原初诱导基因的类型
• 1.1.2 生长素原初诱导基因的特征
• 1.1.3 Aux/IAA 基因家族
• 1.1.4 生长素原初诱导基因的时空表达
• 1.1.5 生长素原初响应基因的顺式作用元件与反式作用因子
• 1.2 生长素极性运输
• 1.2.1 生长素极性运输的特点
• 1.2.2 生长素极性运输的载体
• 1.2.3 生长素极性运输的调控机理
• 1.2.4 生长素极性运输与植物的生长和发育
• 1.3 生长素受体
• 1.3.1 生长素结合蛋白 ABP1
• 1.3.2 拟南芥 TIR1 基因编码生长素受体
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 取材
• 2.2.2 植物组织总 RNA 的提取及检测
• 2.2.3 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.4 纯化及加尾
• 2.2.5 目的基因全长cDNA 的分离
• 2.2.6 表达载体的构建和转化农杆菌
• 2.2.7 农杆菌介导的毛白杨遗传转化
• 2.2.8 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.9 转基因植株的检测和表型分析
• 3 结果与分析
• 3.1 毛白杨生长素因子基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 毛白杨 PtPIN1 基因的克隆与序列分析
• 3.1.2 PtIAA1 基因的克隆与序列分析
• 3.1.3 PtTIR1 基因的克隆与序列分析
• 3.2 PtPIN1、PtIAA1 和PtTIR1 表达载体的构建
• 3.3 超表达PtAUX1 基因的表达分析及转拟南芥植株的发育和形态变化
• 3.3.1 PtAUX1 基因在拟南芥各器官普遍表达
• 3.3.2 PtAUX1 基因影响拟南芥植株的形态和根的生长
• 3.3.3 PtAUX1 基因参与拟南芥叶和表皮毛的发育
• 3.3.4 PtAUX1 基因影响拟南芥花器官的形态特征和组织结构
• 3.3.5 PtAUX1 转拟南芥改变了果实的形态
• 3.4 毛白杨 PtTIR1 基因的功能分析
• 3.4.1 PtTIR1 促进毛白杨植株的生长
• 3.4.2 超表达 PtTIR1 影响叶片的发育
• 3.4.3 PtTIR1 的向性反应及对激素 IAA 的刺激反应
• 3.4.4 超表达 PtTIR1 转基因系的再生芽体异于野生型
• 4 讨论
• 4.1 四个生长素因子基因的序列分析
• 4.1.1 毛白杨PtAUX1 和PtPIN1 是生长素运输载体
• 4.1.2 PtIAA1 基因是生长素快速响应因子
• 4.1.3 毛白杨 PtTIR1 是生长素受体基因
• 4.2 PtAUX1 和PtTIR1 参与顶端分生组织的形成
• 4.3 PtAUX1 影响表皮毛的发育
• 4.4 超表达PtAUX1 和PtTIR1 改变了叶片的极性建成
• 4.5 PtAUX1 和PtTIR1 可能调控花器官发育
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间主要研究成果