甘蓝型油菜与Lesquerella fendleri及菘蓝族间杂种的遗传研究

论文摘要

植物种、属间的远缘杂交是作物遗传改良的重要途径。芸薹属作物具有非常丰富的近缘种资源，可提供许多有用的细胞核和细胞质基因。但这些野生种在栽培条件下产量低，难以直接用于农业生产，解决这一问题的有效途径，是将控制特定性状的目标基因引入栽培作物中，培育所期望的品种。将野生近缘种的有利基因转入作物的主要方法是通过有性杂交及体细胞杂交获得杂种及后代，然后通过大量的回交及自交选育出理想的基因型。十字花科（Brassicaceae）葶苈族（Drabae）植物Lesquerellafendleri(2n=12，无中文名在国外被认为是油菜育种和驯化的首选资源之一，因其种子含油量高于25％，特别是具有重要工业用途的羟基脂肪酸Lesquerolic acid含量达60％以上，其种子饼粞的氨基酸种类丰富，赖氨酸含量高，且抗干旱。另一重要的染料与药用植物菘蓝（Isatis indigotica Fort．，2n=14，又名大靛），属十字花科独行菜族（Lepidieae）菘蓝属二年生草本植物。从菘蓝叶中可提取靛蓝色素，用于染料。菘蓝的根称为板蓝根，为一种常用中药，具有清热、解毒、凉血消斑、抑菌和杀虫等多种功效，并且抗烟草花叶病毒和油菜菌核病。本研究通过有性杂交和体细胞杂交获得了甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri及菘蓝的族间远缘杂种，并对杂种及其后代进行了形态学、细胞学和分子生物学的分析，主要结果如下：1．甘蓝型油菜×LesquerelIa fendleri。在该组合中共获得27株杂种，其中植株5，6，9，17，20，21，27为种子苗，其余20株通过胚培养方式获得。F1植株及其后代在形态上主要表现甘蓝型油菜性状，只有少数具有父本L.fendleri的一些特征，如花期较长，基部分枝及与抗旱相关的种子吸水后出现的胶膜层等性状。根据细胞学结果将F1杂种植株分为5类：第一类（16株），染色体数目为2n=38；第二类（2株），染色体数目为2n=38-42；第三类（3株），染色体数目为2n=31-38；第四类（5株），染色体数目为2n=25-31；第五类（1株），染色体数目为2n=19-22。大多数杂种及其后代都是混倍体，并且通过基因组原位杂交（GISH）只检测到1-2条外源染色体及一些染色体片断。AFLP分析发现在所有杂种一代及其回交或自交后代中都检测到Lesquerella fendleri特异带、油菜母本的缺失带以及双亲均无的新增带。另外通过脂肪酸分析，在部分杂种后代中检测到亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸以及芥酸含量都较油菜亲本有所升高，可能是由于Lesquerella fendler中与羟基脂肪酸形成及去饱和作用有关的LFAH12基因转入到杂种的基因组中。2．甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞杂交2．1杂种植株的再生。重点分析了外植体生理状态、酶液组成、硝酸银浓度以及激素种类和浓度对原生质体分离和生长分化过程的影响，研究表明原生质体的分离和分化受到以上所有因素影响。在菘蓝（+）821，菘蓝（+）华双3号及菘蓝（+）奥罗（Oro）的3个体细胞杂交组合中，共获得愈伤数237个，2株对称融合杂种，13株非对称融合杂种，植株再生频率为6．7％。2．2杂种和回交后代的形态学。F1杂种在幼苗期叶片颜色均呈深绿色，叶表面覆有厚的蜡质，叶片肥厚。杂种植株在成熟期时株高比甘蓝型油菜矮、开花较晚，雄蕊发育不完全，在绝大多数的花中只含有3-5枚雄蕊，雄蕊空瘪不含花粉，花药颜色与菘蓝相似，呈褐色，并散发出菘蓝花特有的香味。雌性部分可育，用甘蓝型油菜大量授粉后产生了少量胚与种子。与甘蓝型油菜的回交一代植株在形态上主要与甘蓝型油菜相似，也表现菘蓝的个别性状，如叶片为深绿色，叶表面覆有厚的蜡质，叶片变厚以及散发出菘蓝的花香。2．3杂种和回交后代的细胞学。植株S2（对称融合）和AS1（非对称融合）的体细胞染色体数目为预期的2n=52，在绝大多数花粉母细胞（PMCs）内染色体表现正常的配对（终变期为26Ⅱ）和分离（后期Ⅰ为26：26），GISH鉴定出7个菘蓝二价体。植株AS4，AS6和AS7为混倍体（2n=48-62），而植株AS12的体细胞染色体数目为66。分析的4株BC1植株的体细胞染色体数目均为2n=45，PMCs减数分裂后期Ⅰ呈22：23、21：24和20：25的主要分离方式，GISH分析显示有7条染色体被菘蓝探针完全标记，并检测出菘蓝染色体的组内配对及与油菜染色体的异源配对。2．4杂种核基因组及胞质基因组组成。AFLP和SSR分析在所有再生杂种植株中都检测出两个亲本的DNA带、两亲本的缺失带以及亲本所没有的新带。利用叶绿体和线粒体通用引物对杂种胞质DNA分析，发现非对称融合杂种AS8、AS9、AS10和AS11的叶绿体来自于菘蓝，其它植株的叶绿体DNA和所有植株的线粒体DNA带型均与甘蓝型油菜一致，未发现细胞质遗传物质重组。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 远缘杂交在植物育种中的作用
• 1.1.1 植物远缘杂交的研究概况
• 1.1.2 芸薹属作物远缘杂交研究
• 1.1.3 远缘杂交在植物育种上的应用
• 1.1.3.1 转移外源有利基因
• 1.1.3.2 脂肪酸的改良
• 1.1.3.3 人工合成复合种和新物种
• 1.2 远缘杂交诱导的异常染色体行为
• 1.2.1 染色体消除
• 1.2.2 染色体加倍
• 1.2.3 亲本染色体组分开
• 1.3 远缘杂交异源多倍体化过程中的表观遗传变异
• 1.3.1 基因沉默
• 1.3.2 DNA甲基化的变异
• 1.3.3 核仁显性
• 1.3.4 转座因子激活
• 1.4 植物体细胞杂交研究
• 1.4.1 植物体细胞杂交研究概况
• 1.4.2 植物原生质体融合方法
• 3法'>1.4.2.1 NaNO₃法
• 2+、高pH法'>1.4.2.2 高Ca²⁺、高pH法
• 1.4.2.3 PEG融合
• 1.4.2.4 电融合
• 1.4.3 植物原生质体融合方式
• 1.4.3.1 对称融合
• 1.4.3.2 非对称融合
• 1.4.4 原生质体融合中染色体丢失的因素
• 1.4.4.1 射线使用剂量和紫外线照射强度的影响
• 1.4.4.2 亲缘关系
• 1.4.4.3 融合亲本染色体的特性和状态
• 1.4.4.4 融合时原生质体所处的细胞周期
• 1.4.5 原生质体融合胞质杂种的获得
• 1.4.6 体细胞杂种的筛选和鉴定
• 1.4.6.1 体细胞杂种的筛选
• 1.4.6.2 体细胞杂种的鉴定
• 第二章 甘蓝型油菜与Lesquerella fendleri族间杂种及后代的遗传分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 花粉管萌发的观察
• 2.2.3 胚抢救
• 2.2.4 细胞学观察
• 2.2.5 花粉的可染性
• 2.2.6 基因组原位杂交
• 2.2.6.1 基因组DNA的提取和探针的标记
• 2.2.6.2 原位杂交制片
• 2.2.6.3 原位杂交
• 2.2.7 AFLP分析
• 2.2.7.1 DNA的酶切与连接
• 2.2.7.2 预扩增
• 2.2.7.3 选择性扩增
• 2.2.7.4 扩增产物的电泳检测
• 2.2.8 脂肪酸含量的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Lesquerella fendleri与油菜的亲和性研究
• 2.3.1.1 L.fendleri花粉与白菜型油菜、芥菜型油菜和埃芥雌蕊的相互作用
• 2.3.1.2 L.fendleri花粉与甘蓝型油菜雌蕊的相互作用
• 2.3.2 甘蓝型油菜与L.fendleri的有性杂交
• 1植株的形态学特征'>2.3.2.1 F₁植株的形态学特征
• 1植株的普通细胞学和GISH分析'>2.3.2.2 F₁植株的普通细胞学和GISH分析
• 1植株的AFLP分析'>2.3.2.3 F₁植株的AFLP分析
• 2.3.2.4 杂种后代形态学、细胞学及AFLP分析
• 2.3.2.5 杂种后代脂肪酸分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 油菜与L.fendleri亲和性的分析
• 2.4.2 甘蓝型油菜与L.fendleri杂种形成的机制
• 2.4.3 远缘杂交过程中染色体消除的机制
• 2.4.4 远缘杂交过程中遗传物质的渗入
• 2.4.5 杂种后代脂肪酸的改变及抗旱性性状的转移
• 第三章 甘蓝型油菜与菘蓝体细胞杂种及后代的遗传分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 叶肉原生质体的分离和纯化
• 3.2.3 下胚轴原生质体的分离和纯化
• 3.2.4 原生质体的培养及植株再生
• 3.2.5 原生质体对称融合及非对称融合细胞的培养和植株再生
• 3.2.5.1 原生质体对称融合和非对称融合供体、受体的前处理
• 3.2.5.2 原生质体融合方法
• 3.2.5.3 原生质体融合细胞的培养和植株再生
• 3.2.6 花粉育性观察
• 3.2.7 体细胞杂种植株鉴定
• 3.2.7.1 细胞学观察
• 3.2.7.2 基因组原位杂交
• 3.2.7.3 AFLP分析
• 3.2.7.4 SSR分析
• 3.2.8 体细胞杂种的核质遗传分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 原生质体的分离
• 3.3.1.1 外植体生理状态对原生质体活力和产量的影响
• 3浓度对原生质体产量和质量的影响'>3.3.1.2 不同酶浓度和AgNO₃浓度对原生质体产量和质量的影响
• 3.3.1.3 原生质体分化过程中生长情况及激素种类和浓度的影响
• 3.3.2 甘蓝型油菜和菘蓝的原生质体融合及植株再生
• 3.3.2.1 碘乙酰胺（IOA）和紫外线（UV）对原生质体的影响
• 3.3.2.2 体细胞杂种植株的再生和分子细胞学分析
• 3.3.4 杂种回交一代的形态学和细胞学分析
• 3.3.4.1 形态学分析
• 3.3.4.2 细胞学和GISH分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 非对称融合中染色体的丢失
• 3.4.2 杂种植株表型与基因组的关系
• 3.4.3 菘蓝基因组内的同源性及其与A、C基因组之间的部分同源性
• 3.4.4 杂种核DNA及细胞质DNA的分析
• 3.4.5 异源附加系的获得及其用途
• 第四章 研究小结与展望
• 4.1 研究结论
• 4.2 创新点
• 4.3 下一步工作展望
• 参考文献
• 个人简介
• 研究论文
• 致谢