柽柳抗逆分子机理研究与相关基因的克隆

论文题目: 柽柳抗逆分子机理研究与相关基因的克隆

论文类型: 博士论文

论文专业: 森林培育

作者: 王玉成

导师: 杨传平

关键词: 柽柳,星星草,抗逆,分子机理,基因克隆

文献来源: 东北林业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 柽柳是抗逆能力强的植物,可以在干旱和盐渍化土壤上良好生长。以柽柳为主要研究材料,应用差异显示、消减杂交、EST分析、基因芯片等技术研究其抗逆分子机理,并对部分抗逆基因进行克隆。建立了两种木本植物总RNA的提取方法。两种方法均以硼砂为缓冲液,分别用SDS、和CTAB为主要提取试剂,可以提取出高质量的木本植物总RNA;SDS方法同时可以用于真菌、昆虫等的RNA提取。对LiCl沉淀方法进行了重要改进,改进的方法可在10min内完全沉淀RNA。用差异显示技术研究了NaHCO3胁迫下柽柳的基因表达情况,经Northern检测共获得了17个基因片段,BlastX分析表明,有2个基因与F-box类蛋白家族成员同源性较高。1个基因与翻译起始因子eIF成员有高的同源性。还获得了分别与分泌型过氧化物酶和过氧化物酶基因同源性高的基因片段,过氧化物酶为植物对抗逆境胁迫的常见基因。另外,有5个与盐碱胁迫密切相关的新序列,它们在胁迫前后差异表达明显。这17个序列的GenBank接受号为CD028574-CD028581和CD028583-CD028591。应用消减杂交技术研究了NaHCO3胁迫下柽柳的基因表达情况,以NaHCO3胁迫柽柳cDNA为试验方（tester）,正常生长柽柳cDNA为驱动方（Driver）。经Northern杂交检测,共获得36个盐胁迫应答基因。BlastX分析表明,它们与下列基因同源:CAT和PRDX 2个抗氧化酶基因;编码海藻糖磷酸酯酶的基因;多种调控基因,包括bZIP转录因子、MADS-box蛋白,富含甘氨酸RNA结合蛋白（Glycine-rich RNA-binding proteins）、CCCH型锌指蛋白、F-box蛋白等的调控基因;早期光诱导蛋白,该基因可以修复由胁迫引起的植物光合系统损伤;半胱氨酸蛋白酶和VPE酶（vacuolar processing enzyme）,它们起降解受损细胞作用;以及脂质转移蛋白前体、聚合泛素、查尔酮合酶、谷胱甘肽转移酶、NADP-IDH、OEE1等;同时,发现了6个盐胁迫应答的新基因。用差异显示技术研究了NaHCO3胁迫下星星草的基因表达情况,经反向Northern检测,获得了7个差异表达基因片段。其中,6个为胁迫后诱导表达的基因,1个为胁迫后抑制表达的基因。序列同源性分析表明,诱导表达的6个基因中,1个与钙依赖性蛋白激酶（CDPK）同源性较高,其余5个为新序列,胁迫后抑制表达的基因与假定adaptor蛋白同源性较高。结果提示,在NaHCO3胁迫后,星星草可能通过CDPK正向调控其抗盐能力,并调控胁迫信号的转换。获得的7个基因片段已经在GenBank登录,登录号为CF198398—CF198404。构建了柽柳的cDNA文库。以NaHCO3胁迫的柽柳为材料建立了cDNA文库,文库的初始滴度为5.7×105pfu,重组率为96%,插入片段平均长度约1.2kb,扩增后文库的滴度为3.9×109pfu/mL。对柽柳进行了EST分析,共获得2455条ESTs序列,它们代表了1936条无重复的单一序列（unique sequence）。共有1452条ESTs与已知基因序列同源,其中:1452条ESTs与Nr数据库蛋白同源,其余1386条为新序列。对EST进行了GO(Gene

论文目录:

摘要

Abstract

1 绪论

1.1 引言

1.2 柽柳的概况

1.2.1 柽柳是一种良好的抗逆研究材料

1.2.2 柽柳的研究现状

1.3 植物基因组学研究进展

1.3.1 结构基因组学研究内容

1.3.2 功能基因组学

1.3.3 比较基因组学

1.4 生物信息学

1.4.1 生物信息学的应用

1.4.2 EST分析技术

1.4.3 ESTs的主要应用

1.5 基因克隆及表达研究技术

1.5.1 RACE技术

1.5.2 基因芯片技术

1.5.3 抑制性消减杂交技术

1.5.4 差异显示技术

1.6 本研究课题的来源及主要研究内容

2 研究目标、研究内容与技术路线

2.1 研究意义

2.2 研究目标

2.3 本实验的研究方法

2.4 技术路线

3 木本植物总RNA提取方法的建立

3.1 柽柳等木本植物总RNA的提取方法的建立

3.2 CTAB法提取植物总RNA研究

3.2.1 材料与方法

3.2.2 结果分析

3.3 SDS法提取植物总RNA

3.3.1 材料与方法

3.3.2 结果分析

3.4 两种RNA分离方法的评价

3.5 木本植物RNA的提取方法的研究

3.5.1 提取植物组织RNA时常遇到的问题

3.5.2 结论与讨论

3.6 本章小结

4 差异显示技术研究柽柳耐盐机理

4.1 材料与方法

4.1.1 材料处理

4.1.2 试剂

4.1.3 总RNA的制备及反转录

4.1.4 mRNA差异显示

4.1.5 PCR产物的测序胶电泳

4.1.6 差异条带的回收及再扩增

4.1.7 反向Northern检测

4.1.8 克隆产物的PCR鉴定

4.1.9 重组质粒的PCR检测

4.1.10 第二次杂交检测

4.1.11 Northern点杂交检测

4.2 结果分析

4.2.1 RNA的检测

4.2.2 柽柳mRNA差异显示

4.2.3 差异显示条带的回收检测

4.2.4 差异基因的反向Northern检测

4.2.5 第二次杂交检测

4.2.6 Northern点杂交检测

4.2.7 基因的测序和序列同源性比较

4.3 结论与讨论

5 差异显示技术研究星星草NaHCO_3胁迫下基因的表达

5.1 材料与方法

5.1.1 材料处理

5.1.2 试剂

5.1.3 RNA的制备与纯化

5.1.4 差异显示

5.1.5 电泳及差异条带的获得

5.1.6 差异表达序列的反向Northern检测

5.1.7 差异表达序列的测序与同源性分析

5.2 结果分析

5.2.1 RNA的质量检测

5.2.2 差异条带的回收

5.2.3 反向Northern检测结果

5.2.4 基因的序列同源性比较

5.3 结论与讨论

6 消减杂交技术研究柽柳抗盐机理

6.1 材料与方法

6.1.1 材料处理

6.1.2 消减杂交的引物序列

6.1.3 总RNA的制备

6.1.4 mRNA的分离与cDNA合成

6.1.5 消减杂交

6.1.6 消减文库的建立

6.1.7 文库克隆序列测定

6.1.8 消减文库的测序及序列同源性分析

6.1.9 消减文库克隆的检测

6.2 结果与分析

6.2.1 总RNA质量的检测和Rsal酶切后cDNA电泳图

6.2.2 消减杂交结果检测

6.2.3 消减文库的反向Northern鉴定结果

6.2.4 文库克隆的Northern杂交分析

6.2.5 抗盐碱相关基因及序列相似性分析

6.3 结论与讨论

7 NaHCO_3胁迫下柽柳基因表达谱的建立

7.1 材料与方法

7.1.1 NaHCO_3处理的柽柳cDNA文库的构建

7.1.2 测序模板的准备与测序

7.1.3 序列的编辑与分析

7.2 结果与分析

7.2.1 柽柳cDNA文库的质量

7.2.2 柽柳文库ESTs的主要特性分析

7.2.3 柽柳文库EST的GO(Gene Ontology)分类

7.2.4 柽柳文库EST的按功能分类

7.3 结论与讨论

7.3.1 高质量cDNA文库的建立

7.3.2 柽柳可能的抗逆途径

7.3.3 NaHCO_3胁迫的柽柳文库构建意义

8 基因芯片技术研究柽柳基因的表达

8.1 材料和方法

8.1.1 材料

8.1.2 柽柳的处理及RNA制备

8.1.3 荧光标记与芯片杂交

8.1.4 数据分析

8.2 NaHCO_3处理芯片结果分析

8.2.1 NaHCO_3处理下柽柳基因芯片表达谱

8.2.2 基因的上调与下调表达

8.3 干旱处理芯片结果分析

8.3.1 基因芯片表达谱

8.3.2 基因的上调与下调表达

8.4 结论与讨论

8.4.1 NaHCO_3胁迫下柽柳基因的表达特点

8.4.2 干旱胁迫下柽柳基因的表达特点

9 干旱与NaHCO_3胁迫下柽柳基因表达的比较分析

9.1 材料方法

9.1.1 高密度表达芯片及杂交

9.1.2 数据分析

9.2 结果分析

9.2.1 干旱、NaHCO_3胁迫下柽柳基因表达谱的建立

9.2.2 干旱和NaHCO_3胁迫下上调或下调表达的基因

9.3 结论与讨论

9.3.1 NaHCO_3、旱胁迫下表达趋势相同的基因

9.3.2 干旱、NaHCO_3胁迫后表达有差异的基因

9.3.3 干旱、NaHCO_3胁迫下表达趋势相反的基因

10 柽柳抗逆基因的克隆

10.1 生物信息学方法克隆全序列抗逆相关基因

10.1.1 材料与方法

10.1.2 结果分析

10.2 RACE技术克隆柽柳抗逆基因

10.2.1 材料与方法

10.2.2 结果分析

10.2.3 讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

发布时间: 2005-10-21

柽柳抗逆分子机理研究与相关基因的克隆

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