南极海洋石油烃低温降解菌的筛选、鉴定及其低温降解特性研究

论文摘要

南极具有独特的地理及气候特征,其主要特点是变化极大的光照辐射、季节性的光照时间。南极海洋系统内常年低温（通常在-1.8℃2.0℃）,高盐（海水中的盐度一般为34‰35‰,海冰中的盐囊和盐通道的盐度可达到150‰）,在这样一个低温、强辐射和高盐度的自然环境里,海洋微生物必然具备了相应独特的生理生化和分子机制,因此,南极微生物不仅是研究在低温条件下生物适应性的极好材料,而且也是获得低温生物活性物质（低温酶、PUFA）和其他低温生物工程菌的最佳来源。随着海上油田的开采和海洋运输的日益频繁,海洋的石油烃污染越来越严重,以致被认为人类最后一块净土的南极大陆也未能幸免。近年来,南极考察、探矿和观光旅游的兴起,特别是大型油轮的沉没,导致大量石油烃泄漏,严重威胁了南极生态系统的安全,已经引起世界各国的广泛重视,在南极这样一个非常脆弱的生态系统,任何小的生态环境污染,都会导致严重的生态系统破坏。生物修复是消除海洋石油烃污染的重要途径,本文从南极海水海冰样品中筛选能低温降解石油烃的低温菌,以期为海洋石油烃污染的低温生物修复技术应用奠定基础。本文采用MMC无机盐液体培养和MMC琼脂平板培养结合的方法,从南极海水海冰样品的细菌筛选能够高效低温降解石油烃的细菌,对筛选到的4株南极低温降解菌进行平板生长和降解率试验;采用16S rRNA分子鉴定方法对4株南极低温降解菌进行鉴定,构建系统发育树;通过生物摇床进行单因素试验确定南极低温降解菌NJ49的最适营养和生长条件;通过萘低温降解、柴油低温降解GC-MS图谱、脱氢酶试验、产生物表面活性剂试验、脂肪酸变化试验,对南极低温降解菌NJ49的降解特性和低温适应性进行研究。主要获得以下结果:1.从南极海水海冰样品中筛选到了4株南极低温降解菌,即NJ41、NJ44、NJ49、NJ289。平板可见计数试验表明,培养20d后NJ41、NJ44、NJ49和NJ289均生长良好,南极低温降解菌NJ49菌液细胞可以接近106.8CFU/ml。对4株南极低温降解菌在15℃时降解试验表明,不同菌株对柴油的降解能力不同,其中南极低温降解菌NJ49降解率为最高,可达68%。2.对4株南极低温降解菌的形态特征观察结果表明,南极低温降解菌NJ41是球形,其直径为1.01.2μm,其余3株降解菌为杆状,长度范围在0.72.8μm之间。4株南极低温降解菌都不形成芽孢,都具有鞭毛可以运动。16S rRNA分子鉴定结果表明:南极低温降解菌NJ41属于动球菌属（Planococcus）;南极低温降解菌NJ49属于希瓦氏菌属（Shewanella）;南极低温降解菌NJ289是假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）;南极低温降解菌NJ44有待进一步鉴定。3.对降解率最高的南极低温降解菌NJ49在各种不同环境条件下的生长以及降解柴油能力的研究结果表明,其生长和降解的最适条件为:初始pH为7.5,温度为15℃,盐度为6%,摇瓶装量为80ml,最佳氮源为硝酸铵,最佳磷源为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物。添加表面活性剂能够促进南极低温降解菌NJ49的生长和降解,尤其是阴离子表面活性剂（SDS）和非离子表面活性剂（鼠李糖脂）合用,提高了菌株的降解率。4.对南极低温降解菌NJ49的低温降解特性的研究结果表明,15℃条件下,它可以在以萘为惟一碳源和能源的无机盐培养基中生长,并对萘进行降解。采用GC-MS测定南极低温降解菌NJ49对柴油的降解,图谱表明,对照柴油中含有C9C26之间的l8种烷烃,而经南极低温降解菌NJ49低温降解处理后的残油组分中,仅能检测到C15C217种烷烃,不仅烷烃的种类明显减少,单一烷烃的含量也减少许多。通过对南极低温降解菌NJ49产脱氢酶试验得知,在5℃时脱氢酶酶活力要低于15℃时的酶活力,表明,低温限定了南极低温降解菌NJ49的酶活力;补给柴油的MMC培养基中脱氢酶活力高于2216E培养基中的酶活力,推断测定的脱氢酶是降解柴油的酶。南极低温降解菌NJ49的产表面活性剂试验结果为,在5℃和20℃条件下,该菌均不产生表面活性剂。根据脂肪酸组成的测定数据,发现南极低温降解菌NJ49在低温（5℃）降解时,其脂肪酸组分发生了变化,不饱和脂肪酸的种类和单种脂肪酸含量均有增加。5℃条件下,南极低温降解菌NJ49能产生多种不饱和脂肪酸,其含量高于中温（20℃）条件的。低温时,南极低温降解菌NJ49的脂肪饱和度降低,由1.22降到0.77,推断该低温降解菌通过脂肪酸变化的方式适应低温下的降解。从南极海水海冰中分离到低温降解石油烃的海洋细菌在国内尚属首次,可以认为这些南极低温降解菌为我国低温海洋石油污染的生物修复提供菌源。对南极低温降解菌的石油烃低温降解特性的研究,将为我国低温海域石油烃污染物的清除,提供有效的生物修复技术方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 海洋石油烃的污染
• 1.1.1 石油烃组成
• 1.1.2 海洋中石油烃污染来源
• 1.1.3 海洋中石油烃污染危害
• 1.1.4 海洋石油污染的处理方法
• 1.2 石油烃的生物降解
• 1.2.1 降解石油烃的海洋细菌
• 1.2.2 石油烃的降解途径
• 1.2.2.1 直链烷烃和支链烷烃的降解
• 1.2.2.2 环烷烃的降解
• 1.2.2.3 苯的降解
• 1.2.2.4 多环芳烃的降解
• 1.2.2.5 与降解有关的基因与质粒
• 1.2.3 影响生物降解的因素
• 1.2.3.1 油的性质与状态
• 1.2.3.2 温度
• 1.2.3.3 营养盐
• 1.2.3.4 溶解氧
• 1.3 低温微生物在海洋污染的生物修复中的作用
• 1.3.1 低温微生物的分布
• 1.3.2 低温降解菌清除海洋油污染
• 1.3.3 低温海洋环境石油烃污染的生物降解及低温修复研究进展
• 1.4 本论文工作的目的和意义
• 2 南极海洋石油烃低温降解菌的筛选
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 细菌样品
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试验方法
• 2.1.4.1 南极细菌的分离纯化
• 2.1.4.2 南极细菌的培养
• 2.1.4.3 低温降解柴油南极细菌的筛选
• 2.1.4.4 低温降解柴油南极细菌的可见计数试验
• 2.1.4.5 柴油标准工作曲线的制备
• 2.1.4.6 柴油降解率的测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 筛选结果
• 2.2.2 15℃时4株低温降解菌的可见计数曲线
• 2.2.3 柴油的最大吸收波长
• 2.2.4 标准工作曲线
• 2.2.5 4 株南极低温降解菌降解能力的测定结果
• 2.3 小结
• 3 4 株南极海洋石油烃低温降解菌的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.1.3 4 株南极低温降解菌16S rRNA 基因序列的测定
• 3.1.3.1 细菌染色体 DNA 的制备
• 3.1.3.2 引物设计
• 3.1.3.3 PCR 扩增
• 3.1.3.4 PCR 产物的纯化
• 3.1.3.5 PCR 产物的克隆
• 3.1.3.6 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 3.1.3.7 阳性克隆的筛选
• 3.1.3.8 质粒的微量提取
• 3.1.3.9 质粒的酶切检验
• 3.1.3.10 产物测序
• 3.1.3.11 序列分析和系统发育树的构建
• 3.1.4 4 株南极低温降解菌表型特征的确定
• 3.1.4.1 4 株南极低温降解菌形态学特征的观察
• 3.1.4.2 4株南极低温降解菌生理生化特性的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 4 株南极低温降解菌的16S rRNA 系统学分析
• 3.2.1.1 PCR 扩增结果
• 3.2.1.2 4 株南极低温降解菌的16S rRNA 基因序列测序结果
• 3.2.1.3 4 株南极低温降解菌的16S rRNA 基因序列分析和系统发育树
• 3.2.2 4 株南极低温降解菌表型特征
• 3.2.2.1 4 株南极低温降解菌形态学特征
• 3.2.2.2 4 株南极低温降解菌生理生化指标的测定结果
• 3.3 小结
• 4 影响南极低温降解菌 NJ49 生长和石油降解率相关因素的试验
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 摇床试验
• 4.1.4 分析方法
• 4.1.4.1 柴油的测定
• 4.1.4.2 南极低温降解菌 NJ49 细菌生长量的测定
• 4.1.5 南极低温降解菌NJ49生长曲线的测定
• 4.1.6 南极低温降解菌 NJ49 降解条件的优化
• 4.1.6.1 培养基初始pH 值对南极低温降解菌 NJ49 降解率影响的测定
• 4.1.6.2 温度对南极低温降解菌 NJ49 降解率影响的测定
• 4.1.6.3 盐度对南极低温降解菌 NJ49 降解率影响的测定
• 4.1.6.4 通气量对南极低温降解菌 NJ49 降解率影响的测定
• 4.1.6.5 氮源对南极低温降解菌 NJ49 降解率影响的测定
• 4.1.6.6 磷源对南极低温降解菌 NJ49 降解率影响的测定
• 4.1.6.7 表面活性剂对南极低温降解菌 NJ49 降解率影响的测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 南极低温降解菌 NJ49 的生长曲线
• 4.2.2 培养基初始 pH 值对南极降解菌 NJ49 降解率的影响
• 4.2.3 温度对南极低温降解菌 NJ49 降解率的影响
• 4.2.4 盐度对南极低温降解菌 NJ49 降解率的影响
• 4.2.5 通气量对南极低温降解菌 NJ49 降解率的影响
• 4.2.6 氮源对南极低温降解菌 NJ49 降解率的影响
• 4.2.7 磷源对南极低温降解菌 NJ49 降解率的影响
• 4.2.8 表面活性剂对南极低温降解菌 NJ49 降解率的影响
• 4.3 小结
• 5 南极低温降解菌 NJ49 的石油烃低温降解特性及其低温适应性
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 试验与方法
• 5.1.3.1 南极低温降解菌 NJ49 对多环芳烃的降解试验
• 5.1.3.2 以 GC-MS 测定南极低温降解菌 NJ49 对柴油的低温降解能力
• 5.1.3.3 南极低温降解菌 NJ49 脱氢酶酶活力的测定
• 5.1.3.4 南极低温降解菌 NJ49 产表面活性剂的测定
• 5.1.3.5 南极低温降解菌 NJ49 脂肪酸组成的测定
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 南极低温降解菌 NJ49 对多环芳烃的降解特性
• 5.2.1.1 南极低温降解菌 NJ49 的生长曲线
• 5.2.1.2 萘标准曲线
• 5.2.1.3 南极低温降解菌 NJ49 对萘的低温降解率
• 5.2.2 南极低温降解菌 NJ49 对柴油降解的 GC-MS 谱图分析
• 5.2.3 南极低温降解菌NJ49 脱氢酶酶活力的测定结果
• 5.2.3.1 TF 标准曲线
• 5.2.3.2 南极低温降解菌 NJ49 产脱氢酶酶活力
• 5.2.4 南极低温降解菌 NJ49 产表面活性剂的测定结果
• 5.2.5 南极低温降解菌 NJ49 的脂肪酸组成
• 5.3 小结
• 6 结语
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表文章
• 致谢