论文题目: 特异性二价核酶基因构建与抗PLRV转基因马铃薯的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 张剑峰
导师: 于嘉林,张鹤龄
关键词: 二价核酶,马铃薯卷叶病毒,复制酶基因,体外切割,转基因马铃薯,抗病性
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的二价核酶序列。将该核酶基因克隆到pGEM-4Z中,构建成体外转录载体pGEM-4ZDR;同时将包含核酶切割识别位点的PLRV-Ch复制酶基因cDNA近5’端的874bp片段反向插入到pGEM-4Z中,构建了体外转录载体pGEM-4ZR5。以线性化的重组质粒pGEM-4ZDR和pGEM-4ZR5为模板,在T7 RNA聚合酶的作用下,分别转录获得核酶RNA和PLRV-Ch复制酶基因5’端负链RNA底物片段。将以上两种RNA转录物混合并经37℃保温后,检测结果表明所得核酶RNA对PLRV-Ch复制酶基因负链RNA在体外具有较强地特异切割活性。 为了进一步培育抗卷叶病毒的转基因马铃薯,将所克隆的核酶基因导入双元质粒pROKⅡ中,获得植物表达载体pROKⅡ/DR,经三亲融合转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pAL4404),用于介导叶盘法转化马铃薯外植体。经PCR和Southern-blot检测,证明目的基因被成功地导入所得马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RNA dot-blot和RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。蚜虫传毒接种PLRV后的抗病性鉴定结果表明,所得到的转基因马铃薯株系分别表现出不同程度的抗病性。其中,经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在续发感染中仍表现出较高的抗病性,产量损失与感病受体品种对照相比明显降低。在防虫、无病小区中进行的产量鉴定试验表明,转核酶基因马铃薯株系间的产量变异幅度较大。其中对PLRV表现高抗的转基因株系L5和J-1产量与未转基因受体品种差异不大,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系奠定了基础。
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 关于核酶结构和机理的研究概况
1.1 第Ⅰ类内含子(Group Ⅰ intron)
1.2 第Ⅱ类内合子(Group Ⅱ intron)
1.3 RNase P
1.4 锤头核酶(Hammerhead ribozyme)
1.5 发夹核酶(hairpin ribozyme)
1.6 HDV核酶
1.7 VS核酶
1.8 核酶的应用展望
2 马铃薯抗病毒基因工程研究进展
2.1 利用外壳蛋白基因(Coat protein CP)介导的抗病性研究
2.2 利用病毒基因调控序列转化马铃薯
2.3 利用复制酶(replicase)基因介导的抗病性
2.4 病毒的运动蛋白基因转化马铃薯
2.5 利用核酶(Ribozyme)切割病毒RNA
2.6 马铃薯自身的抗病毒基因
3 本研究的究目的与意义
第二章 特异性双价核酶基因的合成及对PLRV复制酶基因负链RNA的体外切割研究
1 导言
2 实验材料
2.1 质粒载体
2.2 各种酶及试剂
2.3 菌种
2.4 寡核苷酸引物
2.5 溶液的配制
3 实验方法
3.1 双价核酶基因的设计
3.2 双价核酶基因的合成
3.3 核酶基因的克隆
3.4 PLRV-Ch复制酶基因5′端反义链RNA体外转录表达载体的构建
3.5 PLRV复制酶基因片段体外转录及核酶切割
4 结果与分析
4.1 人工合成双价核酶片段的测定
4.2 核酶基因的克隆
4.3 PLRV-Ch复制酶基因片段反义链RNA体外转录表达载体pGEM-4ZR5的构建
4.4 核酶及底物RNA的体外转录
4.5 核酶的体外切割活性测定
5 讨论
5.1 关于核酶切割点及靶序列的选择
5.2 互补序列的选择
5.3 核酶对底物的体外切割活性
第三章 转核酶基因马铃薯的构建与抗病毒测定
1 导言
2 实验材料
2.1 植物材料
2.2 毒源
2.3 载体和菌种
2.4 酶和化学试剂
2.5 引物
2.6 抗体
2.7 溶液
3 实验方法
3.1 基本方法见第二章
3.2 核酶基因植物转化载体的构建
3.3 转化大肠杆菌
3.4 三亲融合实验
3.5 农杆菌介导的马铃薯转化
3.6 植物总DNA的提取
3.7 植物总RNA的提取
3.8 PCR扩增反应
3.9 RT-PCR
3.10 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.11 杂交探针的标记
3.12 RNA dot blot
3.13 Southern杂交
3.14 酶联免疫吸附(ELISA)试验
3.15 转基因株系的抗性试验
4 结果分析
4.1 植物转化载体的构建
4.2 转化农杆菌LBA4404中双元载体的检测
4.3 马铃薯再生培养基的优化
4.4 马铃薯再生株系的获得
4.5 转基因植株中核酶基因的PCR检测
4.6 转基因植株的Southern检测
4.7 RNA dot blot检测
4.8 转基因植株中核酶基因的分析
4.9 转基因马铃薯株系的抗病性分析
5 讨论
第四章 结论
参考文献
缩略词
附录
致谢
发布时间: 2005-07-18
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