甜菜M14品系特异表达基因编码蛋白性质的研究

论文摘要

甜菜M14品系具有无融合生殖特性。为了研究甜菜M14品系特异表达基因M14-263和M14-341编码蛋白的性质,为进一步将两基因转化入模式植物奠定基础,解开基因M14-263和M14-341的功能之谜,本实验以pET-28a为基础载体,利用E.coli BL21（DE3）表达体系,将甜菜M14品系表达基因M14-263和M14-341的cDNA全长分别重组于原核表达载体pET-28a,成功建立了甜菜M14品系特异表达基因M14-263和M14-341的原核表达体系。经SDS-PAGE凝胶电泳及Western印迹检测表明,两个融合蛋白正确表达,其中M14-263融合蛋白的分子量约为26kD,M14-341融合蛋白分子量约为36kD。为了优化融合蛋白表达条件,提高蛋白表达量,本实验选择可能影响蛋白表达的四个因素（培养时间、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度）作为研究对象,设计了四因素三水平正交实验。极差和方差分析结果显示:影响融合蛋白M14-263表达条件的关键因子为诱导时间,培养时间和诱导温度对M14-263蛋白表达量有一定的影响作用,而IPTG浓度的影响效果不显著;影响融合蛋白M14-341表达条件的关键因子为诱导温度,诱导时间和IPTG浓度的影响次之,培养时间的影响不显著。实验结果表明,融合蛋白M14-263的最优表达条件为:IPTG浓度1.2mmol/L,培养时间3h,诱导时间6h,诱导温度37℃,此条件下获得的融合蛋白M14-263占菌体总蛋白的百分比高达33.2%,融合蛋白M14-263浓度为401.9mg/L;融合蛋白M14-341的最优表达条件为:IPTG浓度0.8mmol/L,培养时间3h,诱导时间7h,诱导温度28℃,此条件下获得的融合蛋白M14-341占菌体总蛋白的百分比较优化前显著提高,达16.1%,融合蛋白M14-341浓度为70.98mg/L。热稳定性研究结果表明,M14-263融合蛋白和M14-341融合蛋白均较稳定。亲水性研究结果表明,M14-263融合蛋白较亲水,与前期生物信息学预测结果一致,但M14-341融合蛋白在前期生物信息学预测中呈疏水性,在本实验中则表现出很强的亲水性,可能是由于蛋白折叠后含有多个亲水的α螺旋,或者由于附加序列的作用导致其具有亲水性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 无融合生殖
• 1.2 甜菜M14品系特异表达基因M14-263和M14-341
• 1.2.1 基因M14-263相关信息
• 1.2.2 基因M14-341相关信息
• 1.3 Rab蛋白
• 1.3.1 Rab蛋白的结构
• 1.3.2 Rab蛋白的定位与功能
• 1.3.3 植物Rab蛋白功能的研究进展
• 1.4 MADS-box基因
• 1.4.1 MADS-box基因所编码蛋白的结构
• 1.4.2 MADS-box基因的功能
• 1.5 原核表达体系的研究进展
• 1.6 本实验内容及目的
• 1.7 本实验技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 表达载体及宿主菌株
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 实验试剂及药品
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 cDNA的制备
• 2.2.2 表达载体的构建
• 2.2.3 阳性克隆子的筛选
• 2.2.4 重组质粒的提取及转化
• 2.2.5 诱导表达目的蛋白及SDS-PAGE电泳检测
• 2.2.6 目的蛋白的Western印迹鉴定
• 2.2.7 重组质粒稳定性鉴定
• 2.2.8 目的蛋白表达条件的优化
• 2.2.9 目的蛋白的热稳定性
• 2.2.10 目的蛋白的亲水性
• 第3章 结果与分析
• 3.1 cDNA的制备
• 3.1.1 甜菜M14品系花器总RNA的制备及检测
• 3.1.2 甜菜M14品系花器总cDNA的制备
• 3.2 表达载体的构建
• 3.2.1 基因 M14-263表达载体的构建
• 3.2.2 基因 M14-341表达载体的构建
• 3.3 阳性克隆子的筛选与鉴定
• 3.3.1 基因M14-263阳性克隆子的筛选与鉴定
• 3.3.2 基因M14-341阳性克隆子的筛选与鉴定
• 3.4 重组质粒转入E.coli BL21（DE3）后的鉴定
• 3.4.1 基因M14-263阳性克隆子的筛选与鉴定
• 3.4.2 基因M14-341阳性克隆子的筛选与鉴定
• 3.5 诱导表达目的蛋白及SDS-PAGE电泳检测
• 3.5.1 M14-263蛋白的SDS-PAGE电泳检测
• 3.5.2 M14-341蛋白的SDS-PAGE电泳检测
• 3.6 目的蛋白的Western印迹鉴定
• 3.6.1 M14-263蛋白的Western印迹鉴定
• 3.6.2 M14-341蛋白的Western印迹鉴定
• 3.7 重组质粒的稳定性鉴定
• 3.7.1 重组质粒pET-28a-M14-263稳定性的鉴定
• 3.7.2 重组质粒pET-28a-M14-341稳定性的鉴定
• 3.8 目的蛋白表达条件的优化
• 3.8.1 M14-263蛋白表达条件的优化
• 3.8.2 M14-341蛋白表达条件的优化
• 3.9 目的蛋白的热稳定性
• 3.9.1 M14-263蛋白的热稳定性
• 3.9.2 M14-341蛋白的热稳定性
• 3.10 目的蛋白的亲水性
• 3.10.1 M14-263蛋白的亲水性
• 3.10.2 M14-341蛋白的亲水性
• 第4章 讨论
• 4.1 影响融合蛋白表达的因素
• 4.2 融合蛋白的性质与生物信息学分析
• 4.4.1 融合蛋白M14-263的性质与生物信息学分析
• 4.4.2 融合蛋白M14-341的性质与生物信息学分析
• 4.3 原核表达载体的选择
• 4.4 Western 印迹中的问题
• 4.5 下一步实验计划
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文