家蚕冷冻精液的人工授精及生存评价研究

论文摘要

本研究对家蚕雌蛾交配囊精液进行了活化及人工授精试验,并采用不同的冷冻方法对家蚕交配囊精液进行低温冷冻保存。对解冻后的精子进行了DNA损伤测定及人工授精试验。对家蚕精子中的超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶及顶体酶的活性测定方法进行了研究,探讨了冷冻前后酶活性的变化及其与人工授精产受精卵率之间的关系。 1 家蚕雌蛾交配囊精液的活化与人工授精 采用姬姆萨染色及显微镜下直接观察家蚕雌蛾交配囊中精液,并用交配囊精液进行人工授精,研究发现:交配20～30 min雌蛾交配囊中精液与雄蛾储精囊中精液一样,精液未被活化,含有大量有核精子束。用不同浓度的胰蛋白酶处理精液后在显微镜下观察与人工授精的结果显示,0.2μg/mL的胰蛋白酶处理精液受精卵得率最高。用胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、胃蛋白酶及琥珀酸钠处理精液,仅胰蛋白酶能够在很好的溶解有核精子束的同时提高无核精子的运动性,也只有胰蛋白酶处理的精液人工授精能够得到受精卵。研究还发现经2倍稀释的精液人工授精效果最佳。 2 家蚕雌蛾交配囊精液的冷冻、解冻及冷冻精子的DNA损伤测定与人工授精 将交配囊精液分别保存在-80℃和液氮中,经过一定时间后将其解冻。并采用单细胞凝胶电泳法对冷冻精子进行了DNA损伤检测,结果发现未加冷冻保护剂的精液经过低温冷冻后部分精子电泳图呈明显的彗星状,其DNA损伤程度与对照组相比差异显著,表明DNA受到了一定程度的损伤;而添加冷冻保护剂的精液无论在-80℃是在液氮中保存,冷冻后其精子的电泳图仍然呈圆形,DNA损伤程度与对照组无显著性差异。 未活化的精液在-80℃和液氮中冷冻后都能产受精卵,但在-80℃保存了3个月后就失去了能育性,而液氮中保存的精液在经历了1年后其受精卵率仍保持在82.2%。研究还发现中系家蚕品种精液的能育性要高于日本系统种、杂交种要高于原种。采用三倍体精子对人工授精后的雌蛾进行再交,结果提高了雌蛾产卵数及受精卵率。 3 家蚕冷冻精液超氧化物歧化酶（SOD）活性分析 超氧化物歧化酶是生物体抗氧化防御体系的重要酶类,不同冷冻方法和冷冻时间对精液SOD活性的影响不同。通过酶活性的测定可以看出提取的精液在5h内酶活性变化不明显;-80℃冷存的精液精子SOD活性随时间呈线性下降,3个月后酶活性仅为冷存前的23%左右;经液氮冷存的精液精子SOD活性下降55%,保存1天与保存3个月的精液精子SOD活性变化不大;精清中的酶活性上升与精子中的酶活性下降趋势相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1.1 人工授精及家蚕生殖细胞冷冻保存研究概况
• 1.2 精液冷冻保存的机理及冷冻保存技术
• 1.2.1 精液冷冻保存的机理
• 1.2.2 精液冷冻保存技术
• 1.3 精液冷冻生存评价
• 1.3.1 精子细胞膜完整性及功能测定
• 1.3.2 临床中精子各项运动变量参数分析
• 1.3.3 顶体完整性及浆膜损害
• 1.3.4 精液中酶活性
• 1.4 生殖细胞冷冻保存的意义及精液品质评定的应用前景
• 第二部分 引言
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.1.1 家蚕精液冷冻保存的意义
• 2.1.2 家蚕精液酶活性研究的意义
• 2.2 本研究的主要试验内容
• 第三部分 家蚕交配囊精液的活化与人工授精
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂和仪器
• 3.1.2 精液的采集
• 3.1.3 人工授精方法
• 3.1.4 不同活化物质对精液活化的影响
• 3.1.5 精液活化观察
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同采集时间精液的染色观察
• 3.2.2 胰蛋白酶浓度对精液活化的影响
• 3.2.3 不同活化物质对精液活化的影响
• 3.2.4 精液稀释浓度对产卵数、受精卵率的影响
• 3.3 讨论
• 第四部分 冷冻精液的DNA损伤测定与人工授精
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 单细胞凝胶电泳
• 4.2.2 活化精液与未活化精液冷冻后的人工授精
• 4.2.3 中系品种与日系品种人工授精结果比较
• 4.2.4 原种与杂交种人工授精结果比较
• 4.2.5 不同冷冻方式、不同冷冻时间精液的人工授精
• 4.2.6 三倍体精子再交对冷冻精液人工授精的影响
• 4.3 讨论
• 第五部分 家蚕冷冻精液超氧化物歧化酶（SOD）活性分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试剂和器材
• 5.1.2 样品
• 5.1.3 测定方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 精液4℃存放时间与酶活性的关系
• 5.2.2 不同冷冻方法及冷冻时间与精子中SOD活性的关系
• 5.2.3 不同冷冻方法及冷冻时间与精清中SOD活性的关系
• 5.3 讨论
• 第六部分 冷冻保存对家蚕精液乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试剂
• 6.1.2 仪器
• 6.1.3 材料
• 6.1.4 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 离心条件的选择
• 6.2.2 底物浓度的选择
• 6.2.3 样品保存时间与LDH活性的关系
• 6.2.4 不同冷存方法及冷存时间与精子中LDH活性
• 6.2.5 不同冷存方法及冷存时间与精清中LDH活性
• 6.3 讨论
• 第七部分 家蚕精子冷冻前后顶体酶活性测定及其与受精卵率的关系
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 顶体酶活性测定方法
• 7.1.3 人工授精方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 孵育温度对顶体酶活性的影响
• 7.2.2 孵育时间对顶体酶活性的影响
• 7.2.3 精液4℃存放时间与顶体酶活性的关系
• 7.2.4 不同冷冻方式对顶体酶活性的影响
• 7.2.5 顶体酶活性与人工授精产卵数及受精卵率的关系
• 7.3 讨论
• 第八部分 小结
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表论文及参加课题一览表