论文题目: 姬松茸菌丝体中抗肿瘤、免疫活性多糖的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 粮食,油脂及植物蛋白工程
作者: 姜荷
导师: 谷文英
关键词: 姬松茸,菌丝体,多糖,抗肿瘤,免疫,提取,结构,羧甲基化修饰
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 姬松茸(Agaricus blazei Murill,AbM)是一种重要的药食兼用真菌。近年来,姬松茸多糖作为抗癌剂、免疫调节剂、抗突变剂和抗菌物质的来源引起了全世界的极大关注。姬松茸发酵生产因其成本低廉、周期短、可全年生产等优点,成为了最具竞争力和吸引力的开发姬松茸活性多糖的有效手段。目前国内外对姬松茸深层发酵发酵菌丝体多糖的研究开发报道不多,在提取方法、分离纯化、结构鉴定等方面缺乏系统、深入的研究。在本论文中,采用实验室5L发酵罐生产的菌丝体为原料,采用不同提取方法对菌丝体多糖进行了分步提取,对其中具有重要研究价值的抗肿瘤免疫活性多糖的提取纯化、结构鉴定及化学修饰进行了研究,主要研究内容如下:采用热水、冷碱、热碱对姬松茸菌丝体中的多糖分步进行提取分离,共得到6种提取物。结合得率及体内外活性实验结果,从中筛选得到热水提取的水溶性粗多糖HWSP、冷碱提取的水溶性多糖组分CAWSP、冷碱提取得到的水不溶而碱溶性组分CAASP这3种主要的具有研究价值的多糖组分,它们的得率分别为7.73%、5.73%、8.58%。证明了热水提取的HWSP该组分在20 mg/Kg.d的实验剂量下,对活体小鼠S180移植实体瘤具有59.84%的抑制率及提高荷瘤小鼠机体免疫力的功效;体外对脾淋巴细胞具有显著地促增殖作用,对肿瘤细胞具有选择性细胞毒作用,对肝癌Bel-7402生长具有显著的抑制作用。采用响应面分析方法,结合体外对脾淋巴细胞增殖的促进增殖及抑制肝癌Bel-7402生长的活性筛选,确定了HWSP的最佳提取工艺条件:提取温度95℃,浸提时间3.5h,水料比3.5:1(湿菌体含水量为85%左右),提取3次,醇沉浓度为85%。采用乙醇分级沉淀、脱蛋白、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化,并结合体外活性筛选实验结果,得到相对分子质量217884Da、分布均一的活性组分DP-HWSP30-21,该组分得率为1.55g/100g干菌。化学组成分析表明,DP-HWSP30-21是一酸性蛋白多糖组分,蛋白质含量29.69%,多糖含量为67.39%,糖醛酸含量为21.41%;蛋白与多糖是多糖链与丝氨酸通过O-糖肽键连接的;含有4种单糖,单糖组成及其摩尔比例为阿拉伯糖:甘露糖:木糖:葡萄糖=0.05:0.16:0.32:1;含有17种氨基酸。体外实验证明DP-HWSP30-21中蛋白链的连接可提高糖链体外促脾淋巴细胞增殖的生理活性,而蛋白链本身无生理活性,即蛋白链对糖链的促淋巴细胞增殖起到了活性修饰的作用;当糖链和蛋白链解离后,对Bel-7402细胞的体外抑制活性则完全丧失,说明蛋白链和糖链的整合连接对该组分体外发挥抑制肝癌Bel-7402细胞生长的细胞毒作用是必需的。DP-HWSP30-21与低浓度的化疗药物DHI联合用药具有明显的协同增效作用;DP-HWSP30-21体外对人正常肝细胞无明显的抑制作用。证明了冷碱(4℃,5% NaOH)提取的水溶性多糖CAWSP在20 mg/Kg.d的实验剂量下,对活体小鼠S180移植实体瘤具有64.66%的抑制率及提高荷瘤小鼠机体免疫力的功效,
论文目录:
缩略符号表
中文摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 肿瘤的治疗现状
1.2 抗肿瘤多糖
1.2.1 抗肿瘤多糖的种类及作用效果
1.2.2 抗肿瘤多糖的作用机理
1.2.3 影响多糖抗肿瘤作用的因素
1.2.4 抗肿瘤免疫多糖类药物的开发利用现状
1.3 姬松茸的研究现状
1.3.1 姬松茸的生物学特征
1.3.2 姬松茸的液体发酵培养
1.3.3 姬松茸的营养价值
1.3.4 姬松茸的生物活性功能
1.3.5 姬松茸抗肿瘤多糖的研究
1.4 本课题的立题背景与意义
1.5 本论文的主要研究内容
参考文献
第二章 菌丝体多糖的提取及活性组分的筛选
2.1 前言
2.2 菌丝体的发酵制备及成份分析
2.2.1 材料与方法
2.2.2 实验设备
2.2.3 结果与讨论
2.2.3.1 姬松茸发酵罐深层发酵基本特性比较
2.2.3.2 姬松茸深层发酵菌丝体的基本营养成分分析
2.3 菌丝体多糖的提取分离及物化特性的研究
2.3.1 材料与方法
2.3.2 结果与讨论
2.3.2.1 姬松茸菌丝体提取物的得率及组成
2.3.2.2 姬松茸菌丝体提取物的颜色及溶解特性
2.3.2.3 姬松茸菌丝体提取物的单糖组成
2.4 菌丝体提取物的生理活性测定
2.4.1 实验材料
2.4.2 实验设备
2.4.3 活性测定方法
2.4.4 数据分析
2.4.5 结果与讨论
2.4.5.1 姬松茸菌丝体水溶性提取物的体外活性实验
2.4.5.2 姬松茸菌丝体提取物的体内抗肿瘤效果的综合评价
2.5 本章小结
参考文献
第三章 菌丝体多糖的热水提取工艺研究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 仪器与设备
3.2.3 实验方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 影响姬松茸菌丝体水提多糖的单因子实验
3.3.2 提取分离工艺参数的RSA 优化
3.3.3 菌丝体的热水提取粗多糖组分与五种市售真菌粗多糖的体外活性比较
3.4 本章小结
参考文献
第四章 菌丝体水提多糖(HWSP)的分离纯化及构效关系初步探讨
4.1 前言
4.2 姬松茸菌丝体水提物中活性组分的乙醇分级初筛
4.2.1 材料与方法
4.2.2 结果与讨论
4.2.2.1 乙醇分级沉淀组分的得率及多糖、蛋白质的组成
4.2.2.2 乙醇分级沉淀组分的体外生理活性实验
4.3 HWSP30 中活性组分的分离纯化、理化性质及构效关系的研究
4.3.1 实验材料
4.3.2 实验仪器
4.3.3 实验方法
4.3.4 结果与讨论
4.3.4.1 HWSP30 组分的脱蛋白处理
4.3.4.2 DP-HWSP30 的离子交换柱层析分离
4.3.4.3 DP-HWSP30-2 的凝胶柱层析分离
4.3.4.4 DP-HWSP30-21 组分的纯度鉴定
4.3.4.5 DP-HWSP30-21 相对分子质量的测定
4.3.4.6 DP-HWSP30-21 化学组成
4.3.4.7 DP-HWSP30-21 红外光谱分析
4.3.4.8 DP-HWSP30-21 中糖肽键的鉴定
4.3.4.9 DP-HWSP30-21 组分构效关系的初步探讨
4.3.4.10 DP-HWSP30-21 与HWSP85 组分间得率及活性的归纳比较
4.4 本章小节
参考文献
第五章 菌丝体冷碱提多糖(CAWSP)的分离纯化及一级结构研究
5.1 前言
5.2 材料与设备
5.3 结果与讨论
5.3.1 CAWSP 离子交换分离纯化及活性成份筛选
5.3.2 CAWSP-2 组分的凝胶柱层析分离纯化及活性成份筛选
5.3.3 CAWSP-211 组分的纯度鉴定
5.3.4 CAWSP-211 组分的紫外扫描图谱
5.3.5 CAWSP-211 组分相对分子质量的测定
5.3.6 CAWSP-211 组分的红外光谱
5.3.7 CAWSP-211 组分的单糖组成
5.3.8 CAWSP-211 组分的核磁图谱
5.4 本章小结
参考文献
第六章 羧甲基冷碱提取多糖(CAASP)的制备及生物活性的研究
6.1 前言
6.2 CAASP 羧甲基化产物取代度的测定方法研究
6.2.1 实验材料
6.2.2 实验设备
6.2.3 实验方法
6.2.4 结果与讨论
6.3 羧甲基化CAASP 制备工艺的研究
6.3.1 实验材料
6.3.2 实验设备
6.3.3 实验方法
6.3.4 结果与讨论
6.3.4.1 一氯乙酸用量对羧甲基化产物取代度及得率的影响
6.3.4.2 氢氧化钠与一氯乙酸摩尔比例对羧甲基产物化取代度及得率的影响
6.3.4.3 微波辐照反应时间对羧甲基化产物取代度和得率的影响
6.3.4.4 反应体系总含水量对羧甲基化产物取代度和得率的影响
6.3.4.5 碱化时间对羧甲基化产物取代度和得率的影响
6.3.4.6 羧甲基化CAASP 的取代度与溶解性的关系
6.3.4.7 羧甲基化CAASP(DS=0.070)的制备工艺确定
6.4 CM-CAASP 的体内外生理活性
6.4.1 体外活性试验
6.4.2 体内活性试验
6.4.3 结果与讨论
6.4.3.1 体外活性实验
6.4.3.2 体内活性试验
6.5 急性毒理试验
6.5.1 试验材料
6.5.2 试验动物
6.5.3 试验方法
6.5.4 观测项目
6.5.5 结果与讨论
6.6 本章小结
参考文献
主要结论
论文创新点
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
发布时间: 2006-07-20
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