番木瓜花粉管转基因技术及RNA介导广谱抗病性的初步研究

论文摘要

番木瓜原产于南美洲，是著名的热带亚热带作物之一。番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）是番木瓜生产上重要的世界性病害，极大地影响世界各地的番木瓜生产及其相关产业发展。为研究番木瓜高抗谱抗病毒的机制以及培育出适合在我国栽培的高抗谱抗环斑病毒且安全性好的番木瓜新品系。本研究采用RNA介导-花粉管转基因技术体系对抗病毒番木瓜品系的培育进行了研究，主要结果如下：1运用RT-PCR技术及相关分子生物学技术对我国海南、云南、广西和广东等7个不同番木瓜生产区的番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）进行了克隆和鉴定分析。结果表明PRSV-CP编码区范围在864-873核苷酸之间，编码蛋白是288-291氨基酸。对分离的7个PRSV-CP的核苷酸及氨基酸序列的比较结果表明大部分序列差异都处于N端，而各产区番木瓜PRSV-CP基因的3′端586—864 bp区段，即278 bp DNA片断的同源率最高，达到98.5％。2采用RT-PCR技术对番木瓜环斑病毒CP基因的同源区段进行了克隆和鉴定分析。序列分析结果表明获得PRSV-CP基因3′端同源率最高的278 bp DNA片段，并分别构建了六种RNA介导的植物表达载体，分别为：p2301CP+、p2301CP-、p2301CPu、p2301CPuL、pBCP+、pBCP-，并通过电激法导入农杆菌中。3采用花粉管通道技术将含有CP基因同源DNA片段的植物表达载体导入番木瓜穗中红植株，通过对花粉管导入时的花朵大小、导入液类别、环境因子等参数进行了较为系统的研究，建立了利用质粒DNA和农杆菌为导入液的花粉管通道技术平台。获得了番木瓜花粉管转基因技术中比较理想的导入条件：受体花一般长3.0-4.5cm；一般供体的花采用3.5cm左右的两性花：而对受体来说，质粒DNA为导入液的一般采用2.0-4.0cm的雌花，农杆菌为导入液的一般采用3.0-4.5cm左右的雌花；转化时间一般选择在晴朗天气，气温在20-30℃时比较适宜。4通过花粉管直接转化技术对6种RNA介导的植物表达载体进行基因转化，获得相应的转基因植株，并对转基因植株进行了分子鉴定，为筛选、培育出高抗谱抗环斑病毒且安全性好的番木瓜株系奠定基础。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、引言
• 1 番木瓜环斑病毒（PRSV）及其抗病策略
• 1.1 番木瓜环斑病概况
• 1.2 番木瓜环斑病毒（PRSV）的分子生物学
• 1.3 番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病策略
• 2 转录后基因沉默与转基因植物中RNA介导的抗性
• 2.1 转录后基因沉默
• 2.2 转基因植物中RNA介导的病毒抗性
• 3 本研究的目的意义和技术路线
• 二、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 PRSV病害情况调查及样品的采集
• 1.2 植物材料
• 1.3 菌种与质粒
• 1.4 试剂和药品
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 我国不同地区番木瓜环斑病毒分离株外壳蛋白基因（PRSVCP）的克隆与序列分析
• 2.2 番木瓜环斑病毒CP基因同源区段的克隆及内含子片断的获得
• 2.3 植物表达载体的构建
• 2.4 重组农杆菌工程菌株的获得及鉴定
• 2.5 PRSV-CP基因3’-端同源序列瞬时表达及其对病毒侵染的影响
• 2.6 花粉管通道法介导外源基因的番木瓜遗传转化
• 2.7 转基因幼苗的检测
• 三、实验结果与分析
• 1 我国不同地区番木瓜环斑病毒分离株外壳蛋白基因（PRSV CP）的克隆与序列分析
• 1.1 PRSV CP的RT-PCR扩增结果
• 1.2 阳性克隆的鉴定
• 1.3 不同分离株CP基因的核苷酸序列测定
• 1.4 不同分离株CP基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较
• 2 番木瓜环斑病毒PRSV CP基因同源区段的获得及植物表达载体的构建
• 2.1 番木瓜环斑病毒PRSV CP基因同源区段的扩增和克隆
• 2.2 PRSV-CP基因同源区段的序列分析
• 2.3 内含子片断的获得
• 2.4 植物表达载体pBCP+的鉴定
• 2.5 植物表达载体pBCP-的鉴定
• 2.6 植物表达载体pC2301-CP+的鉴定
• 2.7 植物表达载体pC2301-CP-的鉴定
• 2.8 植物表达载体pC2301-CPU的鉴定
• 2.9 植物表达载体pC2301-CPUL的鉴定
• 3 重组农杆菌工程菌株的获得及鉴定
• 4 GUS组织化学染色
• 5 瞬时表达PRSV CP基因同源序列对番木瓜环斑病毒侵染的影响
• 6 花粉管介导番木瓜PRSV CP基因转化与果实的生长
• 6.1 花粉管介导番木瓜基因转化的适宜时间及措施
• 6.2 花粉管通道法转化番木瓜的成活率
• 6.3 花粉管通道法转化番木瓜T1种子萌芽率
• 7 转基因植株的PCR检测
• 四、讨论
• 1 关于我国PRSV CP的克隆与序列分析
• 2 载体构建策略
• 3 根癌农杆菌介导的瞬时基因表达体系的研究
• 4 花粉管通道技术在番木瓜遗传改良中应用前景
• 五、结论
• 六、进一步研究展望
• 参考文献
• 博士后工作小结
• 致谢