论文摘要
第一章自发性高血压模型鼠肾组织中Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达状况及福辛普利和缬沙坦对其的干预作用目的:观察自发性大鼠肾脏组织中Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达状况,探讨其在高血压肾间质纤维化中的作用及福辛普利和缬沙坦肾保护作用的机制方法:22周雄性SHR 20只随机分为4组（每组5只）:高血压组（SHR组）、Fosinopril组（Fos组,10mg/Kg/d灌胃）、Valsartan组（Val组,50mg/Kg/d灌胃）和Fosinopril+Valsartan组（Fos+Val组,Fosinopril 10mg/Kg/d+Valsartan 50mg/Kg/d灌胃）;22周龄雄性WistarKyoto大鼠（WKY组）5只为对照组。用药物干预实验,连续喂养8周,8周后检测各组大鼠体重、尾动脉压,24小时尿蛋白定量,HE染色观察肾脏病理改变,用免疫组织化学和Western Blot检测肾组织中Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1蛋白的表达状况,用RT-PCR检测肾组织中Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA的表达状况,分析各组实验结果。结果:1.实验第8周为实验终点（30周龄）,研究结果显示:SHR组收缩压、Scr明显高于WKY组（均P＜0.05）,用Fosinopril和/或Valsartan干预实验后,Fos组,Val组及Fos+Val组大鼠收缩压、Scr明显低于SHR组（均P＜0.05）;而实验前与试验后第8周Fos组、Val组和Fos+Val组尿蛋白的排泄量差值ΔUPro均高于SHR组（均P＜0.05）。2.病理学检查方法（HE染色）结果显示:SHR组大鼠肾组织出现高血压肾损害的病理改变,经用Fosinopril和/或Valsartan干预后,肾损害明显改善。3.免疫组化结果显示,正常大鼠肾小管上皮细胞胞浆内有少量Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1蛋白表达;在SHR组肾组织,Klotho蛋白表达均下调,而MMP-9、TIMP-1、PAI-1蛋白表达均上调;而用Fosinopril和/或Valsartan干预SHR模型后,可上调Klotho蛋白在Fos组、Val组（均P＜0.01）和Fos+Val组（P＜0.05）的表达;同时下调MMP-9（均P＜0.01）、TIMP-1（均P＜0.05）蛋白在Fos组、Val组和Fos+Val组的表达;下调PAI-1蛋白在Fos组（P＜0.01）、Val组和Fos+Val组（均P＜0.05）的表达。4.RT-PCR结果显示,SHR组。肾组织Klotho mRNA表达下调,而MMP-9、TIMP-1、PAI-1 mRNA表达均上调;用Fosinopril和/或Valsartan干预实验后发现,SHR模型Fos组、Fos+Val组（均P＜0.01）和Val组（P＜0.05）Klotho mRNA的表达上调,同时这三组的MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA的表达均是下调（均P＜0.01）。相关分析表明,Klotho mRNA的表达与MMP-9、TIMP-1、PAI-1 mRNA的表达均呈负相关关系（r值分别为-0.864,-0.725和-0.785,均P＜0.01）。5.Western Blot结果显示,用Fosinopril和/或Valsartan干预SHR实验第8周后,在Fos组（P＜0.05）、Val组和Fos+Val组（均P＜0.01）肾组织中Klotho蛋白的表达上调,同时这三组MMP-9、TIMP-1和PAI-1蛋白均出现低表达。各组相关分析表明,Klotho蛋白的表达与MMP-9、TIMP-1、PAI-1蛋白的表达均呈负相关关系（r值分别为-0.614、-0.579和-0.552,均P＜0.05）。本章小结:1.SHR模型肾组织中Klotho mRNA和蛋白的表达下调,同时MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA和蛋白的表达均上调。用Fosinopril和Valsartan干预后,上调其肾组织Klotho mRNA和蛋白表达的同时也下调了MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA和蛋白的表达。2.肾组织中Klotho基因表达与MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达呈负相关关系,提示Klotho基因表达下调与ECM降解相关基因有着密切的关系。3.Fosinopril和/或Valsartan抗肾纤维化作用可能与Klotho基因调控MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达有关,且抗衰老基因Klotho可能通过下游靶基因MMP-9、TIMP-1和PAI-1表达而发挥其生物学特性。第二章人类肾小管上皮细胞中Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达状况及福辛普利和缬沙坦对其干预的研究目的:观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激人类肾小管上皮细胞HK-2后,Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达状况,探讨Fosinopril和Valsartan对其干预的影响。方法:HK-2与干预药物共培养24h,分为4组:血管紧张素Ⅱ组(Ang组,10-7mol/L),Fos组:Fosinopril(10-5mol/L)+AngⅡ(10-7mol/L),Val组:Valsartan(10-5mol/L)+AngⅡ(10-7mol/L),Fos+Val组:Fosinopril(10-5mol/L)+Valsartan(10-5mol/L)+AngⅡ(10-7mol/L);另外用正常HK-2作为对照组（Control组）。用免疫组织化学和Western Blot检测HK-2中Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1蛋白的表达,用RT-PCR检测HK-2中Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA的表达,并进行相关分析。结果:1.免疫组化结果显示,正常HK-2中有一定量的Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达,AngⅡ可以诱导HK-2 Klotho蛋白表达下调和MMP-9、TIMP-1、PAI-1蛋白表达上调。Fosinopril和/或Valsartan干预AngⅡ刺激的HK-2后,可上调Klotho蛋白和下调MMP-9和TIMP-1蛋白在Fos组、Val组和Fos+Val组的表达（均P＜0.05）;下调PAI-1蛋白在Fos组（P＜0.01）、Val组和Fos+Val组（均P＜0.05）的表达。2.RT-PCR结果显示,AngⅡ可以诱导HK-2 Klotho mRNA表达下调和MMP-9、TIMP-1、PAI-1 mRNA表达上调。用Fosinopril和/或Valsartan干预AngⅡ刺激的HK-2后,可上调Klotho mRNA和下调PAI-1mRNA在Fos组（均P＜0.05）、Val组和Fos+Val组（均P＜0.01）的表达,同时下调MMP-9、TIMP-1在Fos组、Val组和Fos+Val组的表达（均P＜0.01）。相关分析表明,Klotho mRNA与MMP-9、TIMP-1、PAI-1mRNA呈负相关关系（r分别为-0.698和-0.835,-0.644,均P＜0.01）。3.Western Blot结果显示,用Fosinopril和/或Valsartan干预AngⅡ刺激的HK-2后,可上调Klotho蛋白和下调MMP-9、TIMP-1蛋白在Fos组、Val组和Fos+Val组的表达（均P＜0.01）,同时下调PAI-1蛋白在Fos组（P＜0.05）、Val组和Fos+Val组（均P＜0.01）的表达。相关分析表明,Klotho蛋白均与MMP-9、TIMP-1、PAI-1蛋白呈负相关关系（r分别为-0.690,-0.823和-0.646,均P＜0.01）。本章小结:1.正常HK-2中有一定量的Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1mRNA和蛋白的表达。2.AngⅡ可诱导HK-2中Klotho mRNA和蛋白的表达下调,并使MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA和蛋白表达上调,提示AngⅡ可通过影响Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA和蛋白的表达,进而影响ECM的降解。Klotho mRNA和蛋白与MMP-9、TIMP-1和PAI-1mRNA和蛋白表达均呈负相关关系,提示AngⅡ作为RAS系统的主要效应肽,可影响肾小管上皮细胞抗衰老基因Klotho和ECM降解相关基因MMP-9、TIMP-1和PAI-1的表达,这些基因均可能与肾间质纤维化有密切关系。3.Fosinopril和/或Valsartan通过阻断HK-2中AngⅡ的作用,在上调Klotho mRNA和蛋白的表达的同时,下调MMP-9、TIMP-1和PAI-1 mRNA和蛋白的表达。提示用ACEI和/或ARB制剂降低AngⅡ水平,调控Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因表达可能是其抗肾纤维化的重要作用机制。结论1.体内外实验均证明,高血压时肾组织Klotho基因低表达,而MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因出现高表达,且Klotho与MMP/TIMP、PAI呈负相关关系,提示高血压肾损害有衰老基因与基质降解基因的参与。2.Fosinopril和/或Valsartan均能有效改善高血压时肾组织Klotho、MMP-9、TIMP-1和PAI-1的表达状况,并改善肾间质损伤。3.Klotho基因与MMP-9、TIMP-1和PAI基因呈负相关关系,提示Klotho基因可能通过影响MMP-9、TIMP-1和PAI-1基因的表达而调控影响ECM的降解过程,进而改善高血压肾损伤时肾间质纤维化的进程,推测Klotho基因可能是通过下游靶基因MMP-9、TIMP-1而发挥生物学特性的。4.Fosinopril和/或Valsartan改善Klotho—MMPs/TIMPs—PAI-1基因的表达水平可能是其抗肾纤维化的重要作用机制。