猪链球菌Ⅱ型MRP基因单价候选疫苗株的研究

论文摘要

猪链球菌Ⅱ型（Streptococcus suis serotye2, SS2）是当前最具致病性和危害性的猪链球菌类型之一,可引起多种人畜共患疾病,甚至死亡。基因工程疫苗同传统灭活疫苗相比,更为安全有效、成本低廉,利于大规模推广。本研究采用已报道的SS2候选中和性抗原——溶菌酶释放蛋白（Muramidase released protein, MRP）和具有免疫佐剂功能的猪源肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素elt基因,并依靠宿主-质粒平衡致死系统,尝试构建无抗生素抗性基因,更为安全稳定的SS2MRP单价候选疫苗株,为SS2防治探索有效方法。本研究共分三个部分。（一）共表达mrp、asd沙门氏菌的构建在无氧条件下采用肉汤培养基培养SS2四川分离株,提取所得菌株的基因组DNA,以此为模板经PCR扩增mrp全长基因,获得的PCR产物与pMD-18T载体连接,转入DH5a中并提取质粒。通过PCR检测mrp是否已插入,Kpn Ⅰ酶切检测mrp插入方向是否正确。选择与LacZ启动子方向相同的重组质粒,再经Pvu Ⅰ酶切,回收大小为5889bp的产物片段,使用T4DNA Polymerase补平末端。同时,以含有天冬氨酸半醛脱氢酶（Aspartic semialdehyde dehydrogenase, ASD）基因的质粒pZLZ1为模板扩增asd全长基因,将其与补平末端的重组质粒连接,插入到重组质粒ampr基因内部,将其电转入asd基因缺陷型大肠杆菌X6097（asd）中,经PCR鉴定构建成功后,将重组质粒转入中间沙门氏菌X3730（asd）中,最后转入asd基因缺陷型的沙门氏菌X4072（asd）中,形成依赖于asd基因的质粒—染色体平衡致死系统。诱导表达并电泳检测MRP蛋白显示重组菌株稳定表达MRP。（二）构建elt基因表达质粒以含有猪源不耐热肠毒素基因elt的质粒pMM085为模板扩增elt基因,并通过设计特异引物在基因两端分别引入MluI和ApaI位点。MluI、Apal双酶切PCR产物与pGEX6-P-1质粒,分别回收1213bp片段和4771bp片段。连接两段回收产物,转入DH5a中。经PCR检测重组质粒构建成功。（三）构建mrp、eltB共表达质粒按照第一部分的方法获得SS2基因组DNA,以此为模板扩增引入了MlsI和SalI位点的mrp基因。将扩增产物克隆至T载体上,命名为pTM。MlsI、SalI双酶切质粒pTM和pGEX6-P-1,分别回收大小为3991bp和4481bp的片段并将两者连接,构建为重组质粒pZM01。与此同时,设计引物以质粒pMM085为模板扩增猪源不耐热肠毒素的抗原表位及其B亚基的基因eltB并加入酶切位点MluI和Apal。双酶切PCR产物与pZM01,回收407bp片段和8286bp片段。连接两者构建成为pZM02,以该重组质粒为模板扩增mrp基因和eltB基因,得到的片段大小与预测相符。以上实验为研制可用于实际防疫工作的安全高效的重组疫苗打下了理论和实践基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 概述
• 1 猪链球菌Ⅱ型研究现状
• 1.1 猪链球菌分类
• 1.2 猪链球菌Ⅱ型（SS2）简介
• 1.3 猪链球菌Ⅱ型毒力因子
• 1.4 猪链球菌型防疫方法
• 2. 免疫佐剂简介
• 2.1 佐剂的分类
• 2.2 常用佐剂
• 2.3 免疫佐剂的安全性
• 3. 本实验的目的和意义
• 4. 技术路线
• 第一部分 共表达mrp和asd重组沙门菌的构建
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 重组质粒与重组菌的构建
• 1.2.2 SDS-PAGE电泳
• 1.3 讨论
• 第二部分 elt重组表达质粒的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三部分 共表达mrp、eltB重组质粒的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组质粒pTM的构建
• 3.2.2 构建重组质粒pZM01
• 3.2.4 构建重组质粒pZM02
• 3.3 讨论
• 总结
• 附录
• 参考文献
• 致谢