胆固醇氧化酶高产菌株的选育及酶学性质初步研究

论文摘要

胆固醇氧化酶（COD,EC1.1.3.6）是胆固醇代谢过程中最重要的酶之一,它可以催化胆固醇生成胆甾4-烯-3-酮（cholest-4-en-3-one）和过氧化氢。近年来,随着研究的不断深入,胆固醇氧化酶越来越被人们所重视,更多的应用于临床制药、食品加工、生物农药等方面。本研究的主要内容包括：胆固醇氧化酶高产菌株的选育；SG03菌株的产酶条件优化；SG03菌株30L发酵工艺的研究；COD的分离纯化和酶学性质的初步研究。首先从不同来源菌株中筛选初始酶活较高的菌株,通过初筛、复筛等一系列实验,发现蜡状芽孢杆菌产胆固醇氧化酶初始酶活较高,达到0.4108 U/mL。对蜡状芽孢杆菌进行紫外+硫酸二乙酯（DES）的复合诱变,诱变后的菌株SG03酶活达到了1.087 U/mL,是原始出发菌株的2.64倍。遗传稳定性检测实验发现,该菌株在传代时产酶活力比较稳定。以复合诱变得到的SG03菌株作为COD产生菌,对其发酵培养过程中的培养基组分、培养条件等进行了一系列的优化。单因素实验中确定葡萄糖为最佳碳源,蛋白胨为最佳氮源,胆固醇含量最佳为0.5%。对培养条件进行优化,发现：pH为7.0时,该菌株发酵液中COD酶活较高,达到1.153 U/mL；培养温度为30℃时,发酵液中COD酶活较高,为1.239 U/mL；摇床的较佳转速为200 r/min。接种量为10%时,胞外COD酶活较大,为1.203 U/mL。菌株培养24 h时,胞外酶活达到最高峰,为1.237 U/mL。响应面优化试验发现,培养基最佳组分为：葡萄糖5.43 g/L,蛋白胨7.11 g/L,胆固醇3.04 g/L。在最适培养基及较佳培养条件下,胆固醇氧化酶的酶活达到了1.463U/mL,比未优化前提高了34.6%。在此基础上,利用30L全自动发酵罐,对SG03菌株发酵产胆固醇氧化酶的发酵工艺进行了研究。通过对菌体生长过程中生物量的测定发现,菌体的生长在36 h时进入稳定期,最大生物量达到了14.13g/L。SG03菌株胞外胆固醇氧化酶的分泌主要在菌体生长稳定期的后期,发酵40 h时酶活达到最高值,为1.246 U/mL。pH、搅拌速率对产酶的影响试验发现：当pH为7.0时,菌体在发酵培养44 h酶活最高,为1.271 U/mL,随后酶活开始下降；当搅拌速率250 r/min时,发酵42 h时胆固醇氧化酶产量达到了1.317 U/mL。对发酵过程中的残糖浓度的测定结果发现,当发酵时间达到48 h,葡萄糖含量已极低,而菌体的生长此时也已进入衰亡期。SG03发酵上清液依次经过70%硫酸铵沉淀、CM Sepharose FF离子交换层析以及Sephadex G-75凝胶层析对胆固醇氧化酶进行了纯化,比酶活达到23.467 U/mg,纯化倍数为11.32倍,回收率为21.6%。对纯化的胆固醇氧化酶的酶学性质进行了初步研究,该酶最适pH为7.0,酶活力在5.0～8.0之间较为稳定；最适温度为30℃,在30℃以下酶活力较为稳定。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 插图和附表清单
• 主要缩略词和符号表
• 第1章 绪论
• 1.1 选题意义
• 1.2 胆固醇与人类健康
• 1.3 胆固醇氧化酶
• 1.4 本文研究目的及研究内容
• 第2章 胆固醇氧化酶高产菌株的选育
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.1.3 培养基（g/L）
• 2.2 方法
• 2.2.1 胆固醇氧化酶活力的测定
• 2.2.2 菌株的筛选
• 2.2.3 紫外+DES复合诱变
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 酶活标准曲线的确定
• 2.3.2 原始高产菌株的选育
• 2.3.3 原始菌株的复合诱变
• 2.4 小结
• 第3章 产胆固醇氧化酶菌种的发酵条件优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂及仪器
• 3.1.3 培养基（g/L）
• 3.2 方法
• 3.2.1 培养基优化
• 3.2.2 培养条件优化
• 3.2.3 响应面优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基的优化
• 3.3.2 培养条件的优化
• 第4章 30L发酵罐小试生产COD发酵工艺初步研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂及仪器
• 4.1.3 培养基（g/L）
• 4.2 方法
• 4.2.1 SG03菌株的30L发酵罐小试生产
• 4.2.2 生物量的测定
• 4.2.3 残糖浓度的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 葡萄糖标准曲线的确定
• 4.3.2 SG03 30L规模发酵过程中的生物量测定
• 4.3.3 SG03 30L规模发酵过程中的产酶特征
• 4.3.4 pH对发酵过程的影响
• 4.3.5 搅拌转速对发酵过程的影响
• 4.3.6 残糖浓度的测定
• 4.3.7 DO的影响
• 4.4 小结
• 第5章 COD的分离纯化及酶学性质初步研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 试剂与仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 蛋白质含量的测定
• 5.2.2 胆固醇氧化酶的分离纯化
• 5.2.3 胆固醇氧化酶酶学性质初步研究
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 蛋白质含量的测定
• 5.3.2 胆固醇氧化酶的分离纯化
• 5.3.3 胆固醇氧化酶酶学性质初步研究
• 5.4 小结
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢