基因工程标签蛋白切割用肠激酶轻链基因的克隆和表达

论文摘要

肠激酶（Enterokinase,EK）是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。分子质量为150 kDa,由1条115kDa重链和1条35 kD轻链组成,天然肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化弧基（轻链）构成,两者通过1个分子间二硫键结合,结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动,催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下,将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶,从而启动各种酶原活化的级联。在pH值（4.5～9.5）、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物。由于经EK裂解融合蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N末端氨基酸序列,因而可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂。但是天然的肠激酶来源毕竟有限,并且提取分离的成本高,加之天然提取的肠激酶易为其它蛋白酶污染,造成切割融合蛋白的同时又降解了目的产物。而基因工程的方法正可以弥补这些不足,因而运用基因工程的方法生产肠激酶广为应用。重组肠激酶轻链（recombinantEnterokinase,rEKL）的分子质量通常为35kDa。rEK体外实验证明有全酶酶切特异性并且相较于天然肠激酶表现出对基因工程融合蛋白底物的酶切活性增强,因而现多采用基因工程的方法生产肠激酶。近年来所做的尝试多是克隆与表达235个氨基酸的轻链为克隆表达乳猪肠激酶（enterokinase）轻链（EKL）编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从乳猪十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pMD18-T载体中,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后,进行全序列分析。结果表明,克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致,得到了编码正确的乳猪肠激酶轻链基因全序列。随后,将目的基因片段插入pGEX-2T中,构建了融合表达载体pGEX-rEKL,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达所获得的pGEX-rEKL经过酶切鉴定和测序,证实其插入方向,读码框架正确,所表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量为61kDa,本研究成功的克隆并且在大肠杆菌内表达了乳猪肠激酶基因,并且进行了重组肠激酶表达条件的优化,为进一步进行重组乳猪肠激酶活性的研究及应用奠定了基础.

论文目录

• 英文缩写词表
• 第一章 综述
• 1 肠激酶的特点
• 2 EK的基因工程研究进展
• 3 融合蛋白中的标签蛋白技术
• 4 展望
• 第二章 肠激酶基因的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 电泳结果
• 2.2 RT-PCR扩增肠激酶基因
• 2.3 克隆与鉴定
• 第三章 肠激酶基因的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.3 基因表达产物的纯化
• 结论
• 参考文献
• 摘要
• Abstract
• 致谢