论文摘要
目的:研究无创性延迟肢体缺血预适应（NDLIP）对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤的保护作用,并探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)在NDLIP延迟保护效应中的作用。方法:健康雄性Wistar大鼠随机分为5组。（1）I/R组（n=22）:心脏冠状动脉左前降支（LAD）实施30 min缺血/120 min再灌注。（2）早期心肌缺血预适应组（EMIP组,n=22）:心脏LAD先行3次5 min缺血/5 min再灌注,随后实施30 min缺血/120 min再灌注。（3）NDLIP组（n=22）:左后肢实施3次5 min缺血/5 min再灌注,每天1次,连续3天,第4天对心脏LAD实施30 min缺血/120 min再灌注。（4）I/R+mitoKATP特异性阻断剂5-羟基癸酸钠（5-HD）组（I/R+5-HD组,n=22）:I/R组大鼠LAD结扎前静脉注射5-HD（9 mg/kg）,LAD结扎25 min开始至再灌注120 min末持续静脉输入5-HD（1 mg/kg）。（5）NDLIP+5-HD组（n=22）:NDLIP组大鼠LAD结扎前静脉注射5-HD（9 mg/kg）,LAD结扎25 min开始至再灌注120 min末持续静脉输入5-HD（1 mg/kg）。从ECG、心肌细胞死亡、心肌抗氧化能力、血管内皮功能以及凝血功能变化等方面评价NDLIP延迟心脏保护作用。监测LAD 30 min缺血/120 min再灌注期间心率（HR）、平均动脉压（MAP）、ECG变化;TTC染色法测定心肌梗死面积,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫组化法检测凋亡相关蛋白Fas、FasL表达情况,HE染色观察心肌形态学改变;比色法测定心肌组织髓过氧化物酶（MPO）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、锰-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、黄嘌呤氧化酶（XOD）活力,丙二醛（MDA）含量,以及血清一氧化氮（NO）浓度;RT-PCR法检测心肌Mn-SOD mRNA含量,ELISA法检测血清内皮素-1（ET-1）含量;凝固法测定凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和纤维蛋白原（FIB）含量。结果:1.NDLIP对大鼠心肌I/R损伤所致心电图变化的影响与I/R组比较,EMIP组和NDLIP组I/R期间ST-段抬高幅度降低（P＜0.01）,室早（VPC）、室速（VT）出现时间推迟（VPC:5.33±2.14 min vs11.85±1.79 min and 8.25±2.15 min,respectively,P＜0.01;VT:6.40±2.77 min vs13.25±1.72 min and 10.16±3.29 min,respectively P＜0.01）,持续时间缩短（VPC:12.09±2.63 min vs 5.13±2.18 min and 6.65±2.20 min,respectively,P＜0.01;VT:10.45±4.24 min vs 3.26±1.69 min and 4.06±1.92 min,respectively,P＜0.01）,VT、VF发生率降低（VT:81.82%vs 22.73%and 50%,respectively,P＜0.05;VF:54.54%vs 13.64%and 18.18%,respectively,P＜0.05）。NDLIP对I/R期间HR和MAP变化无显著性影响。2.NDLIP对大鼠心肌I/R损伤后心肌细胞死亡的影响与I/R组比较,EMIP组和NDLIP组心肌梗死面积缩小（IS/AAR%:32.4±10.1%vs 19.0±5.9%and 21.4±9.4%,respectively,P＜0.05）,MPO活性降低（1.05±0.16 U/g vs 0.89±0.05 U/g and 0.77±0.11 U/g,respectively,P＜0.05）,心肌细胞凋亡减少（TUNEL:31.66±3.74%vs 20.67±1.30%and 22.09±1.76%,respectively,P＜0.01）,凋亡相关蛋白Fas、FasL表达阳性指数降低（Fas:28.51±1.31%vs 21.91±2.15%and 22.21±1.84%,respectively,P＜0.01;FasL:26.81±1.43%vs 19.75±1.80%and 19.95±1.74%,respectively,P＜0.01）,心肌形态学损伤减轻。EMIP和NDLIP保护作用相当。3.NDLIP对大鼠心肌I/R损伤后抗氧化能力的影响与I/R组比较,EMIP组和NDLIP组心肌T-SOD（144.78±16.47U/mgprotvs 162.26±6.41 U/mgprot and 162.67±14.21 U/mgprot,respectively,P＜0.05）、Mn-SOD（46.37±12.18 U/mgprot vs 76.49±17.57 U/mgprot and 75.67±3.36U/mgprot,respectively,P＜0.01）、GSH-PX（79.38±7.95 U/gprot vs 90.62±9.80U/gprot and 92.74±7.76 U/gprot,rcspectively,P＜0.05）活力增强,Mn-SOD mRNA表达增加（Mn-SOD/β-actin%:41.36±14.91%vs 61.46±10.73%and 79.18±21.92%,respectively,P＜0.05）,XOD活性（91.20±10.69 U/gprot vs 81.34±7.23 U/gprot and76.29±8.77 U/gprot,respectively,P＜0.05）和MDA含量（2.01±0.17 nmol/mgprot vs1.79±0.18 nmol/mgprot and 1.68±0.11 nmol/mgprot,respectively,P＜0.05）降低。EMIP和NDLIP保护作用相当。4.NDLIP对大鼠心肌I/R损伤前后血管内皮功能的影响缺血前,与I/R组比较,EMIP组和NDLIP组血清NO浓度升高（11.88±2.46μmol/L vs 14.85±2.00μmol/L and 15.09±2.82μmol/L,respectively,P＜0.05）,ET-1/NO比值降低（0.2526±0.0673 vs 0.2005±0.0528 and 0.1834±0.0490,respectively,P＜0.05）。再灌注后,EMIP组和NDLIP组血清ET-1升高程度降低（4.10±0.30 ng/ml vs 3.50±0.34 ng/ml and 3.21±0.49 ng/ml,respectively,P＜0.01）,NO浓度得到保留（7.21±1.29μmol/L vs 10.23±0.82μmol/L and11.18±2.52μmol/L,respectively,P＜0.01）,ET-1/NO比值升高程度降低（0.5790±0.1571 vs 0.3448±0.0492 and 0.3105±0.0695,respectively,P＜0.05）。EMIP和NDLIP保护作用相当。5.NDLIP对大鼠心肌I/R损伤前后凝血功能的影响缺血前,各组凝血指标无显著性差异。再灌注后,与I/R组比较,EMIP组和NDLIP组FIB升高程度较I/R组显著降低（238.28±22.19 mg/dl vs214.73±22.33 mg/dl and 216.54±14.52 mg/dl,respectively,P＜0.05）,各组间PT和APTT无明显差异。6.mitoKATP在NDLIP保护效应中的作用与I/R组比较,I/R+5-HD组各项指标均无显著性差异,说明5-HD自身对I/R损伤无影响。NDLIP诱导的上述保护作用在NDLIP+5-HD组均消失或减弱。与NDLIP组比较,NDLIP+5-HD组I/R期间ST-段抬高幅度增加（P＜0.05）,VPC、VT出现时间提前（VPC:8.25±2.15 min vs 6.28±2.29 min,P＜0.01;VT:10.16±3.29 min vs 6.81±2.85 min,P＜0.01）,持续时间延长（VPC:6.65±2.20 min vs 10.31±5.14 min,P＜0.01;VT:4.06±1.92 min vs 9.35±4.17 min,P＜0.01）,VT、VF发生率升高（VT:50%vs 81.82%,P＜0.05;VF:18.18%vs 50%,P＜0.01）。I/R后心肌梗死面积扩大（21.4±9.4%vs 34.9±14.7%,P＜0.05）,MPO活力升高（0.77±0.11 U/g vs 0.98±0.24 U/g,P＜0.05）,心肌细胞凋亡指数增加（22.09±1.76%vs 27.28±1.38%,P＜0.01）,Fas、FasL表达阳性指数增加（Fas:22.21±1.84%vs 26.53±1.56%,P＜0.01;FasL:19.95±1.74%vs 24.65±1.85%,P＜0.01）,心肌形态学损伤加重。心肌T-SOD（162.67±14.21 U/mgprot vs145.07±14.02 U/mgprot,P＜0.05）、Mn-SOD（75.67±3.36 U/mgprot vs 44.75±15.33U/mgprot,P＜0.01）、GSH-PX（92.74±7.76 U/gprot vs 79.00±7.51 U/gprot,P＜0.01）活力降低,Mn-SOD mRNA表达减少（79.18±21.92%vs 54.62±15.31%,P＜0.05）,XOD活力（76.29±8.77 U/gprot vs 94.73±10.66 U/gprot,P＜0.01）和MDA含量（1.68±0.11 nmol/mgprot vs 2.10±0.23 nmol/mgprot,P＜0.01）增加。血清ET-1浓度升高（3.21±0.49 ng/ml vs 3.91±0.22 ng/ml,P＜0.01）,NO水平降低（11.18±2.52μmol/L vs 7.71±1.47μmol/L,P＜0.01）,ET-1/NO比值升高（0.3105±0.0695 vs0.5372±0.0976,P＜0.01）。血浆FIB浓度增加（216.54±14.52 mg/dl vs 234.23±22.40mg/dl,P＜0.05）。结论:1.NDLIP明显降低I/R所致ST-段抬高幅度,推迟缺血期VPC、VT出现时间,缩短其持续时间,降低恶性室性心律失常发生率,具有延迟抗心律失常作用,其保护作用强度与EMIP相当。NDLIP对I/R所致MAP和HR变化无影响。2.NDLIP能缩小I/R所致心肌梗死面积,减少心肌细胞凋亡,改善心肌形态学改变,其抗细胞死亡的延迟保护作用强度与EMIP相当。机制可能与降低MPO活力,下调凋亡相关蛋白Fas、FasL表达有关。3.NDLIP能增强I/R损伤心肌的抗氧化能力,减轻过氧化损伤,此作用强度与EMIP相当。4.NDLIP能增加基础状态下的血清NO浓度,使ET-1与NO之间的平衡向NO移动。I/R后,NDLIP减轻血管内皮功能障碍,保留血清NO浓度,降低ET-1升高幅度,使ET-1与NO之间的平衡接近正常,其保护作用强度与EMIP相当。5.NDLIP对基础状态下的凝血功能无影响,但能降低I/R后血浆FIB增加程度,可能是其延迟心脏保护作用机制之一。6.mitoKATP的开放参与介导NDLIP上述延迟保护作用。
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