王艺1周丽1许广大1吕申2（1辽宁省大连大学附属新华医院肛肠科116021;2大连医科大学附属二院病理中心116021）
【摘要】目的通过对大肠癌组织中P-gp表达情况的检测，分析P-gp表达与大肠癌临床病理参数的关系，探讨利用其评估大肠癌多药耐药性的可能性，希望能为大肠癌综合化疗方案的制定提供一些帮助。?方法?本研究收集大连大学附属新华医院自2011年1月至2011年12月间经手术切除的大肠癌标本306例，应用免疫组化方法，检测此306例大肠癌组织中P-gp表达情况，同时将Ki67蛋白作为细胞增殖的标志一并检测其表达情况；分析P-gp表达情况与患者的性别、年龄以及肿瘤的生长部位、分化程度、肠壁浸润深度、淋巴结转移情况、Ki67蛋白表达之间的关系。?结果?P-gp表达阳性率在本组大肠癌组织中为77.12%。其表达与肿瘤浸润深度呈显著正相关关系(P=0.038＜0.05)；与淋巴结转移情况二者之间差异显著(P=0.022＜0.05)；与Ki67蛋白表达二组之间差异显著(P=0.007＜0.05)。然而，P-gp的表达与患者的性别、年龄及肿瘤的生长部位、分化程度之间均无显著相关关系(P＞0.05)。?结论?通过对大肠癌组织中P-gp表达情况的检测，可以对大肠癌的多药耐药性做出评估，对化疗方案的制定提供帮助。
【关键词】大肠癌，P-gp，Ki67，多药耐药性
大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，大肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第3位[1]。在我国，根据国内大肠癌流行病学调查资料显示，其发病率在各种恶性肿瘤中仅次于肺癌及乳腺癌排在第3位，死亡率已居第4位[2]。目前临床上对大肠癌的治疗多采用手术为主结合化疗的综合性治疗方案，辅助性化疗是其中非常重要环节。但目前化疗效果仍难以令人满意，这其中肿瘤的多药耐药性是导致化疗失败的重要原因。因此，本研究以P-gp作为耐药标志，检测其在大肠癌中的表达情况，希望通过分析其表达与大肠癌临床病理参数的关系，能够对肿瘤的耐药状态做出正确评估，可以对化疗方案的确定提供帮助。
1资料与方法
1.1临床资料：收集大连大学附属新华医院自2011年1月至2011年12月间经手术切除的大肠癌标本306例，所有患者术前均未接受过放、化疗治疗。患者临床资料完整，其中男性168例，女性138例，年龄32岁-89岁，平均年龄63.18岁。按年龄分<60岁组117例与≥60岁组189例；按肿瘤的生长部位分直肠癌216例、乙状结肠癌63例、降结肠癌5例、横结肠癌4例及升结肠癌18例；按分化程度分高分化腺癌19例、中分化腺癌227例与低分化腺癌、粘液腺癌及印戒细胞癌60例；参照2002年国际抗癌联盟UICC公布的恶性肿瘤TNM分期标准[3],按浸润深度分为侵及粘膜下层T1期7例、侵及固有肌层T2期61例、穿透肌层至浆膜下层T3期218例及穿透脏层腹膜或侵及其他脏器或组织T4期20例；按淋巴结转移情况分有淋巴结转移组137例及无淋巴结转移组169例。
1.2试剂及方法：试剂为鼠抗人Ki67单克隆抗体、鼠抗人P-gp单克隆抗体，均购自福州迈新生物技术开发公司。应用免疫组化染色方法检测大肠癌组织中P-gp表达情况；并同时检测Ki67蛋白表达，以此作为细胞增殖标志。
1.3结果评定标准：Ki67蛋白表达结果判定参照Hashimoto等[4]：Ki67表达于细胞核，胞核呈现棕黄色或棕褐色颗粒，连续观察10个高倍镜视野，以核阳性细胞数为百分比评分，阳性细胞计分方法：<10%为(+)；10%-50%为(++)；>50%为(+++)。仅将(+++)级考虑为高表达，归为高表达组，将(+)和(++)级考虑为低表达，归为低表达组。
P-gp表达位于细胞浆，阳性反应为棕色，每张切片在高倍镜下连续计数l0个视野，计算其阳性率。判断标准：阳性细胞数<10%为阴性(-)，10%-25%为(+)，25%-50%(++)，>50%为(+++)。其中将(-)定为阴性表达，(+)、(++)、(+++)定为阳性表达。
1.4统计学方法：本组实验资料的统计学处理均通过SPSS13.0统计软件包进行。计数资料间差异采用X2检验分析，P<0.05时认为具有统计学意义。
2结果
2.1Ki67在大肠癌中的表达
Ki67蛋白表达于细胞核，与大肠癌临床病理参数之间的关系详见表1。按其表达强度，分为Ki67蛋白高表达组144例及低表达组162例。
分析得出：Ki67蛋白的表达与肿瘤分化程度呈显著负相关关系(P=0.016＜0.05)，但与患者的性别、年龄及肿瘤的生长部位、肠壁浸润深度、淋巴结转移之间均无显著相关关系(P＞0.05)。提示细胞分化程度差、恶性度高的大肠癌组织中Ki67蛋白呈现高表达，可以将其作为细胞增殖标志之一，并据此将大肠癌分为Ki67蛋白高、低表达两组。
2.2P-gp在大肠癌中的表达
P-gp表达位于细胞浆，其与大肠癌临床病理参数之间的关系详见表2，在大肠癌组织中P-gp阳性表达肿瘤为236例，阴性表达肿瘤为70例，其表达阳性率在大肠癌组织中为77.12%(236/306)。
分析得出：P-gp的表达与肿瘤肠壁浸润深度呈显著正相关关系(P=0.038＜0.05)；与淋巴结转移之间差异显著(P=0.022＜0.05)；与Ki67蛋白的表达二组之间差异显著(P=0.007＜0.05)。然而，P-gp的表达与患者的性别、年龄及肿瘤的生长部位、分化程度之间均无显著相关关系(P＞0.05)。
3讨论
大肠癌的发生发展是一个多阶段、多因素的长期而复杂过程，目前对其的诊断及治疗手段有很大进展，但其预后仍不理想，而其对化疗药物产生耐药性是导致对其治疗失败的主要原因之一。本研究以P-gp为原始耐药标志，检测其在大肠癌组织中的表达；同时检测Ki67蛋白表达情况，以此作为细胞增殖标志，通过分析P-gp表达与大肠癌临床病理参数的关系，探讨利用临床病理参数评估大肠癌多药耐药的可行性。
3.1多药耐药的概念
人们在多年的临床实践中，发现乳腺癌、卵巢癌以及白血病等恶性肿瘤开始对化疗比较敏感，但随着化疗的进展，均出现不同程度的耐药性，从而引起肿瘤复发，而耐药性肿瘤不仅对已接触过药物耐药，而且对多种化学结构不同及作用机制不同的化疗药物均产生耐药，这就是肿瘤的多药耐药性(multidrugresistance，MDR)。这是一种独特的广谱耐药现象，它是肿瘤的重要耐药机制，是肿瘤化疗失败的主要原因之一。MDR有两种类型，分为内在性耐药(intrinsicdrugresistance)和获得性耐药(acquireddrugresistance)两类，既原发的存在于某些肿瘤中的耐药，称为内在性耐药；继发于化疗后的耐药，称为获得性耐药[5]。肿瘤细胞耐药性产生的机制非常复杂，但均与多种耐药相关的酶和蛋白的表达有关。
3.2Ki67蛋白在大肠癌中的表达及意义
Ki67抗原是一种细胞周期相关核抗原，常简称为Ki67或Ki-67，是应用最广泛的增殖细胞标记之一。其主要分布于增生性高的或转化性高的组织细胞核中，在非增生性的或低转化性的组织中几乎不表达。研究表明[6]，Ki67与人类多种实体肿瘤相关。其表达与肿瘤组织分化程度及恶性程度呈正相关，即肿瘤组织分化程度越差、恶性度越高，Ki67表达越高，可以作为鉴别肿瘤良恶性及判断肿瘤侵袭力的标志。
本研究通过免疫组化方法检测了306例大肠癌组织中Ki67蛋白的表达情况，结果显示Ki67蛋白的表达与肿瘤分化程度呈显著负相关关系(P=0.016＜0.05)，即分化程度较差的腺癌较分化程度较好的腺癌增殖活跃，即随着大肠癌的恶性度增高，癌细胞的增殖活性有增强趋势。但其表达与患者的性别、年龄及肿瘤的生长部位、肠壁浸润深度、淋巴结转移之间均无显著相关关系(P＞0.05)。本研究结果提示细胞分化程度差、恶性度高的大肠癌组织中Ki67蛋白呈现高表达，肿瘤细胞增殖旺盛，可以将Ki67蛋白作为细胞增殖标志之一，并据此将大肠癌分为Ki67蛋白高、低表达两组，应用在P-gp的检测中，作为临床病理参数之一。
3.3P-gp在大肠癌中的表达及意义
1976年，Juliano和Ling[7]最先在耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现：MDR和细胞膜上170KD糖蛋白的增加有关，这种蛋白质被命名为P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)。P-gp的跨膜结构具有通道蛋白的特点。
P-gp是一种能量依赖性蛋白，广泛的存在于正常细胞中，但其分布具有组织特异性，目前发现其广泛存在于肾上腺、肝脏、肺等各种正常细胞中，而在一些特定器官的细胞中会有高表达，例如胆管内皮细胞、小肠和结肠上皮细胞、肾小管上皮细胞等,因此，认为P-gp在正常组织中的生理功能主要是排泄和(或)保护组织以避免受到一些正常存在于人体的毒素或外源性化学物质的伤害[8]。但当其存在于肿瘤细胞中时，若肿瘤细胞受到外界刺激如化疗药物的细胞毒作用时，作为一种保护性机制能特异性地使P-gp表达增高，识别并结合药物分子，P-gp利用ATP水解后释放的能量直接或间接将药物泵出细胞，或借P-gp本身的通道作用将药物从细胞内泵出细胞外，导致肿瘤细胞内药物浓度降低、细胞毒作用减弱或丧失，导致肿瘤多药耐药，称为经典MDR。P-gp可介导不同结构的药物，包括长春新碱(VCR)、依托泊苷(VP-16)、蒽环类抗生素、紫杉烷类、鬼臼乙叉甙、丝裂霉素C[9]等产生耐药性，而且其表达量的增加与细胞耐药性呈正相关。同时，这种泵出机制是非选择性的，从而导致肿瘤细胞对这种内源性P-gp介导的MDR很难发生逆转，最终所有的化疗药物都可能由于细胞摄入量的不足而都不敏感或耐药，影响化疗效果。
大肠癌是P-gp表达水平最高的肿瘤之一，本研究306例大肠癌组织中P-gp的表达阳性率77.12%(236/306)，阳性率较高，Peters等[10]和DeAngelis等[11]认为P-gp的阳性表达率为38%-96%，我们的研究结果与其相符。这表明P-gp在大肠癌的多药耐药机制中发挥重要作用，P-gp过度表达是大肠癌产生多药耐药的主要原因；这也解释了为何相当一部分患者在化疗早期即对化疗药物耐药，原因就是相当一部分大肠癌组织继承了正常大肠组织的特性，在治疗前就已有P-gp过度表达，导致了大肠癌多药耐药的产生，从而最终对化疗耐药或者不敏感，化疗失败。提示我们较多的大肠癌有P-gp的表达，应注意在化疗早期时就避免选择P-gp所介导的抗癌药物如长春新碱、阿霉素、紫杉醇等。
同时本组研究中P-gp的表达与肿瘤浸润深度呈显著正相关关系(P=0.038＜0.05)，与淋巴结转移之间差异显著(P=0.022＜0.05)，即侵袭性较强的大肠癌患者P-gp的阳性表达高于侵袭性较弱的大肠癌患者，说明P-gp常在侵袭性较强的大肠癌表达，该发现不但提示侵袭性较强的肿瘤常会出现原发性多药耐药，同时还提示P-gp将可能成为反映肿瘤恶性生物学行为的标记物，作为评估肿瘤转移的指标之一，而且这也与临床上这部分患者对化疗耐药或不敏感相符。而本组中P-gp的表达与患者的性别、年龄及肿瘤的生长部位、分化程度之间均无显著相关关系(P＞0.05)，这表明P-gp虽然在化疗早期就可能引起大肠癌的多药耐药，但其在不同性别、不同年龄组别的患者以及不同部位和分化程度的大肠癌患者之间所引起的多药耐药几率没有显著差异，提示我们不能通过以上病理参数来判断患者对化疗的敏感性和有针对性的选择化疗药物。
P-gp表达阳性率在Ki67蛋白高表达组与低表达组中为84.03%与70.99%，二组间差异显著(P=0.007＜0.05)，即Ki67蛋白呈现高表达、细胞增殖旺盛的大肠癌组织中，P-gp的阳性表达也较高，也就是说临床上细胞增殖旺盛、分化程度差的大肠癌Ki67蛋白呈现高表达，亦常有P-gp的表达，虽然其本身应对化疗有较高的敏感性，但由于P-gp的过度表达可能导致这类患者存在原发耐药，反而对化疗耐药或不敏感，提示我们对这类患者在选择化疗方案时应注意避免选择P-gp所介导的抗癌药物。
总之，通过本次研究，提示我们P-gp的过度表达能够导致大肠癌多药耐药的发生，并在化疗早期就可表现出来，而且可能导致原本对化疗敏感的肿瘤产生原发耐药，并在一定程度上反映了肿瘤的恶性生物学行为。因此，通过对大肠癌组织中P-gp表达情况的检测，能够对大肠癌的多药耐药性做出评估，对化疗方案的制定提供帮助，提示我们在设计化疗方案时应选用与MDRl无关的药物或加用异搏定、奎尼丁等逆转剂或采用加大药物剂量等治疗措施，以避免无效治疗，产生毒副作用，甚至导致病情恶化。附表
表1Ki67蛋白表达与CRC临床病理参数之间的关系
参考文献
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