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细胞死亡调控与食管癌化疗敏感性相关研究

2020-12-11阅读(1095)

细胞死亡调控与食管癌化疗敏感性相关研究

论文摘要

化疗药物诱导肿瘤细胞死亡,细胞死亡依据形态学可分为细胞凋亡、细胞自嗜性死亡和细胞坏死。相关研究表明,细胞凋亡失调在肿瘤的发生发展及肿瘤对抗癌药物的敏感性中具有重要的作用。然而细胞凋亡调控基因Smac和c-IAP1与食管癌化疗敏感性的相关机理尚不清楚,有待深入研究。论文第一部分发现促凋亡蛋白Smac在食管癌组织中表达降低（36.8%,25/68,P=0.001）, Smac蛋白在晚期食管癌组织的表达水平与食管癌患者化疗疗效相关。而凋亡抑制蛋白c-IAP1在食管癌组织胞浆表达量增加。依据食管癌组织中获得的信息,选择两株高表达Smac的食管癌细胞系,利用RNAi干扰技术,敲低Smac的表达,显著增加了细胞对化疗药物顺铂的耐药性。分子机制研究提示,在Smac敲降的食管癌细胞中,显著降低CDDP诱导线粒体膜通透性的改变,抑制Cytochrome c蛋白分子自线粒体的释放,阻滞下游内源凋亡通路的活化,抑制了细胞凋亡。体内外实验结果显示,Smac缺乏显著降低了食管癌细胞对化疗敏感性,增加细胞的耐药性。同时,高表达c-IAP1食管癌细胞经CDDP处理后,细胞通过Smac介导c-IAP1降解,促进了细胞凋亡。利用Smac模拟小分子LBW242有效的增加了低表达Smac的食管癌细胞对化疗药物的敏感性。该研究发现并揭示了细胞凋亡调控基因Smac低表达与食管癌化疗敏感性的密切关系,可能在食管癌化疗敏感性的调控中发挥着重要的作用。论文第二部分首次揭示细胞坏死调控关键基因RIP3在食管癌组织中表达量显著增加（67.9%,36/53,P=0.001）。在细胞凋亡失调的食管癌细胞系KYSE 140中,经CDDP处理,细胞通过RIP3启动并调控细胞坏死,维持了细胞对化疗的敏感性。利用RNAi干扰技术,敲低RIP3的表达,阻断了KYSE140细胞坏死通路,显著增加了KYSE140细胞对顺铂的耐药性。分子机制研究提示,在内源缺乏Smac的KYSE140细胞中,CDDP诱导Caspase-9降解,阻断了凋亡内源途径的活化；RIP3可诱导表达通过与代谢相关的ENO1结合,促进了代谢和ROS的产生,导致细胞坏死。发现食管癌细胞中存在核型的RIP3蛋白表达,可能在调控CDDP诱导细胞凋亡坏死过程中发挥重要的作用。该研究首次揭示了RIP3在食管鳞状细胞癌的表达情况,及RIP3所调控细胞坏死途径与食管癌化疗敏感性的相关性。RIP3可能在食管癌化疗敏感性的调控中发挥着重要的作用论文第三部分发现在食管癌细胞中,利用量子点荧光纳米材料偶联凋亡诱导因子（AIF）抗体,可对食管癌细胞内的AIF蛋白进行特异性标记。依据荧光猝灭原理,揭示偶联抗体的量子点较传统的有机荧光的光稳定性强,不易漂白,适合长时间检测。同时,发现直径5纳米的游离量子点在DAPI和紫外的协同作用下,可进入细胞核,形成稳定的细胞核标记。综上所述,细胞凋亡相关的Smac、c-IAP1基因和细胞坏死相关的RIP3基因通过对细胞死亡通路的调节,可能在食管癌化疗敏感性的调控中发挥着重要的作用。量子点纳米材料可有效的应用于细胞的荧光标记。

论文目录

  • 目录
  • 图表索引
  • 英文缩略词索引表
  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 参考文献
  • 第一部分 凋亡相关基因与食管癌化疗敏感性关系及机理研究
  • 前言
  • 材料和方法
  • 一、材料
  • 1. 食管癌组织标本
  • 2. 菌种与载体
  • 3. 实验相关药品和试剂
  • 4. 实验室主要仪器
  • 二、研究方法
  • 1. DNA相关实验和方法
  • 2. 细胞相关实验和方法
  • 3. 蛋白质相关实验和方法
  • 4. 小鼠移植瘤相关实验和方法
  • 结果
  • 一、Smac在食管癌组织标本的表达
  • 1. Smac在食管癌与癌旁组织中的表达
  • 2. Smac在经化疗治疗的中晚期食管癌组织中的表达
  • 3. Smac在食管癌细胞系的表达
  • 二、顺铂对食管癌细胞系EC0156的细胞毒作用
  • 1. 顺铂诱导食管癌细胞凋亡的剂量和时间依赖性
  • 2. 细胞流式检测CDDP诱导食管癌细胞凋亡
  • 3. 细胞流式检测CDDP诱导食管癌细胞线粒体膜透性改变
  • 4. 集落形成分析CDDP对食管癌细胞长期存活能力的影响
  • 三、CDDP诱导细胞凋亡的分子机制
  • 1. CDDP促进Smac和Cytochrome c蛋白由线粒体向胞浆的释放
  • 2. CDDP促进食管癌细胞的Caspase3的活化
  • 四、Smac shRNA干扰稳定克隆鉴定
  • 五、Smac shRNA干扰的稳定克隆降低了食管癌细胞的化疗敏感性
  • 1. Smac敲降降低EC0156食管癌细胞对化疗药物敏感性
  • 2. 流式分析Smac-KD细胞对顺铂的敏感性
  • 3. Smac敲降增加细胞的长期存活能力
  • 4. Smac敲降降低了CDDP诱导食管癌细胞线粒体膜透性改变
  • 六、Smac敲降对食管癌细胞线粒体形态的影响
  • 七、Smac敲降对CDDP诱导细胞内源凋亡通路的影响
  • 1. Smac敲降降低了细胞线粒体蛋白Cytochrome c向胞浆的释放
  • 2. Smac敲降降低了CDDP诱导食管癌细胞的Caspase9和Caspase3活化
  • 八、体内实验smac敲降对化疗的敏感性的影响
  • 1. 亲本EC0156和Smac-KD细胞的致瘤实验
  • 2. CDDP对亲本EC0156细胞移植瘤的抑瘤作用
  • 3. CDDP对Smac-KD G10细胞移植瘤的抑瘤作用
  • 4. Smac敲降降低了CDDP对EC0156细胞移植瘤的抑瘤作用
  • 5. TUNEL分析CDDP处理后EC0156和Smac-KD移植瘤的凋亡细胞
  • 九、Smac模拟小分子的增敏效应
  • 1. Smac模拟小分子重建Smac敲降细胞对化疗的敏感性
  • 2. 细胞流式检测联合LBW242和CDDP诱导食管癌细胞凋亡
  • 十、联合LBW242和CDDP诱导细胞凋亡的分子机制
  • 1. Smac模拟小分子促进Cytochrome c蛋白由线粒体向胞浆的释放
  • 2. Smac模拟小分子促进食管癌细胞的Caspase9的活化
  • 十一、c-IAP1对食管癌的化疗敏感性的影响
  • 1. c-IAP1在食管癌细胞系的表达
  • 2. c-IAP1在食管癌与癌旁组织中的表达
  • 3. 高表达c-IAP1敲降Smac蛋白增加食管癌细胞对顺铂的耐药性
  • 4. Western blot分析凋亡相关分子表达
  • 讨论
  • 一、Smac和c-IAP1的表达与肿瘤发生发展
  • 二、Smac和c-IAP1的表达与食管癌化疗敏感性
  • 三、Smac调控细胞凋亡的分子机制
  • 1. Smac与Cyto C的反馈调控机理
  • 2. Smac与c-IAP1协同调控细胞凋亡
  • 四、Smac模拟小分子促进了肿瘤细胞放化疗敏感性
  • 1. Smac模拟小分子的增敏机制
  • 2. Smac模拟小分子的应用前景
  • 五、展望
  • 小结
  • 参考文献
  • 第二部分 细胞坏死调控与食管癌化疗敏感性关系及机理研究
  • 前言
  • 材料和方法
  • 一、材料
  • 1. 食管癌组织标本
  • 2. 菌种与载体
  • 3. 实验相关药品和试剂
  • 4. 实验室主要仪器
  • 二、研究方法
  • 1. DNA相关实验和方法
  • 2. 细胞相关实验和方法
  • 3. 蛋白质相关实验和方法
  • 4. 小鼠移植瘤相关实验和方法
  • 结果
  • 一、顺铂对食管癌细胞系KYSE14的细胞毒作用
  • 1. Smac缺失的KYSE140食管癌细胞系对顺铂敏感性
  • 2. 细胞流式检测CDDP诱导食管癌细胞凋亡
  • 3. 细胞流式检测CDDP对食管癌细胞线粒体膜透性的影响
  • 4. CDDP诱导KYSE140细胞坏死依赖激酶RIPK1
  • 5. Nec-1抑制CDDP诱导KYSE140细胞坏死
  • 二、CDDP诱导细胞坏死的透射电镜结果
  • 三、细胞坏死调控基因RIP3在食管癌细胞系的表达
  • 四、CDDP诱导细胞坏死的分子机制
  • 1. CDDP诱导RIP3表达及Caspase-9降解
  • 2. CDDP处理KYSE140细胞不影响凋亡相关分子表达
  • 3. CDDP促进KYSE140细胞的AIF和Bax蛋白的转位
  • 4. 细胞流式检测CDDP诱导KYSE140细胞ROS产生
  • 五、RIP3免疫共沉淀发现RIP3与ENO1的相互作用
  • 1. 改进的免疫共沉淀技术增加了方法的特异性
  • 2. 确定最佳抗体和蛋白G最佳交联时间
  • 3. RIP3蛋白与ENO1的相互作用
  • 六、RIP3稳定克隆的鉴定及RNA干扰效果的鉴定
  • 1. RIP3 shRNA干扰稳定克隆的鉴定
  • 2. RIP3过表达稳定克隆的鉴定
  • 七、RIP3 shRNA干扰的稳定克隆对食管癌的化疗敏感性的影响
  • 1. MTT分析KYSE140 RIP3敲降对CDDP的剂量依赖性
  • 2. RIP3敲降增加食管癌细胞的长期存活能力
  • 八、RIP3在KYSE140细胞内的定位
  • 1. 免疫荧光检测RIP3在细胞内的定位
  • 2. RIP3在细胞胞浆和细胞核中表达
  • 九、RIP3过表达食管癌细胞体内致瘤性
  • 1. RIP3过表达的食管癌细胞降低了体内致瘤性
  • 2. 移植瘤组织HE染色结果
  • 十、RIP3在食管癌组织标本的表达
  • 1. RIP3在食管癌与癌旁组织中的表达
  • 讨论
  • 一、细胞的两种死亡方式的相互调控
  • 二、细胞坏死调控的分子机制
  • 三、RIP3细胞核内定位的作用
  • 四、RIP3的表达与肿瘤发生发展及食管癌化疗敏感性
  • 小结
  • 参考文献
  • 第三部分 纳米材料量子点细胞标记的生物学应用
  • 前言
  • 材料和方法
  • 一、实验相关药品和试剂
  • 1. 主要试剂
  • 2. 抗体
  • 3. 实验室主要仪器
  • 二、研究方法
  • 1. 游离量子点制备及抗体偶联
  • 2. 细胞相关实验和方法
  • 结果
  • 一、抗体偶联量子点标记细胞
  • 1. MPA-QD与AIF抗体偶联
  • 2. 抗体偶联量子点特异标记食管癌细胞
  • 二、量子点荧光具有抗荧光猝灭性
  • 三、游离量子点入核标记
  • 四、游离量子点入核的时间依赖性
  • 五、不同细胞系的量子点入核现象
  • 六、游离量子点进入细胞核的机制
  • 1. 特异抗体结合抑制了游离量子点入核
  • 2. 比较量子点与细胞核孔复合物的大小
  • 讨论
  • 一、量子点细胞标记的应用
  • 二、量子点入核现象的可能机理
  • 三、量子点荧光标记的生物应用前景
  • 小结
  • 参考文献
  • 基金资助
  • 文献综述一 IAP家族分子与肿瘤靶向治疗
  • 参考文献
  • 文献综述二 RIP3-细胞凋亡与坏死的调节阀
  • 参考文献
  • 博士在读期间发表的文章
  • 致谢
  • 个人简历
  • 接受及待发表文章摘要
  • 附录 发表的文章及专利

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