论文摘要
人溶菌酶是一类杀菌机制完全不同于抗生素的溶菌蛋白,其抗菌机制是水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺中的p-1,4糖苷键,在渗透压作用下导致细菌细胞壁破裂而发生溶菌作用。本实验室以LYZ基因作为信息探针,克隆了一个和LYZ有一定同源性的LYC4基因,该基因的成熟蛋白由127个氨基酸编码,其N端含有一段由18个氨基酸组成的信号肽序列,同源比较显示LYC4和人溶菌酶LYZ同源性为38%,且两者二维结构非常相似。LYC4基因长度,预测分子量及其八个形成二硫键的半胱氨酸保守结构符合C型溶菌酶的特征,属于C型溶菌酶基因家族。早期研究发现,通过Northern blot分析LYC4在人体16种组织种的表达谱,发现LYC4在附睾组织中特异性表达,进一步的原位杂交和免疫组化分析显示,LYC4蛋白在附睾上皮内的表达丰度从附睾头到附睾尾逐渐减弱。Western blot方法在人体精液及小鼠的附睾头、附睾体和附睾尾,均检测到约14kDa的预期分子量的蛋白条带。并用his-tag融合表达的方法成功表达了人溶菌酶LYC4蛋白。然而,通过大肠杆菌表达LYC4溶菌酶,表达蛋白量和活性均不高,在此基础上,本实验利用毕赤酵母系统表达LYC4蛋白,毕赤酵母表达系统具有转化子遗传稳定、准确加工、高效表达的特点,能够在非选择压力下实现稳定传代,且可直接表达具有生物活性的人溶菌酶。根据毕赤酵母密码子偏爱性对LYC4基因进行优化设计,优化后的基因克隆至具有乙醇氧化酶启动子（AOX1）的pPIC9K载体中。通过电转化方法整合到甲醇营养型毕赤酵母表达菌株GS115基因组上,再利用不同浓度梯度的G418抗性YPD固体培养基筛选高拷贝转化子,经摇瓶发酵后,其上清液在SDS-PAGE胶上14.4 kDa处出现明显的蛋白条带,该蛋白条带经质谱鉴定证明是人LYC4蛋白。以人溶菌酶（164071U/mg）作为标准品,使用艳红微球菌作为底物,通过比色法测定LYC4溶菌酶蛋白的活性,结果显示重组人溶菌酶LYC4蛋白具有明显的溶菌活性,其酶活力可达38893U/ml。