载脂蛋白A-I的在LTA诱导的小鼠急性肺损伤及脓毒血症中的治疗作用

论文摘要

本实验采用改良的冷乙醇沉淀法,从血浆F-Ⅳ组分中提取纯化人血浆载脂蛋白A-Ⅰ（Apolipoprotein A-Ⅰ,ApoA-Ⅰ）,经聚乙二醇浓缩后,用150 mmol/L磷酸缓冲液透析,得到可用于实验用纯化的ApoA-Ⅰ。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹法（westernblot）鉴定分离得到的蛋白为纯化的ApoA-Ⅰ。对LTA激活的巨噬细胞细胞毒性抑制作用的实验显示,制备得到的ApoA-Ⅰ具有生物活性。用磷脂壁酸（LTA）激活小鼠腹腔巨噬细胞,加入不同浓度ApoA-Ⅰ（终浓度分别为0,10,50,100μg/ml）共同培育,3小时后将巨噬细胞上清液加到L-929细胞中,MTT法检测LTA激活的巨噬细胞释放的细胞因子对L-929细胞的杀伤作用。结果表明,ApoA-Ⅰ显著降低LTA激活的巨噬细胞造成的L-929细胞的死亡率,且这种作用具有剂量效应:LTA组L-929细胞死亡率为（51.32±5.06）%,10μg/ml Apo A-Ⅰ+LTA组L-929细胞死亡率为（46.33±1.95）%,50μg/ml Apo A-Ⅰ+LTA组L-929细胞死亡率为（33.10±2.71）%（P＜0.01）,100μg/ml Apo A-Ⅰ+LTA组L-929细胞死亡率为（29.62±1.36）%（P＜0.01）,50μg/ml Aoo A-Ⅰ+10%LFF+LTA组L-929细胞死亡率为（15.73±0.65）%（P＜0.01）,LTA+10%LFF组L-929细胞死亡率为（45.47±5.06）%。本实验说明,ApoA-Ⅰ可以明显抑制LTA激活的巨噬细胞释放细胞因子,且ApoA-Ⅰ的作用具有剂量效应,而且,10%无脂蛋白血浆本身没有抑制LTA激活巨噬细胞的功能,却可以加强ApoA-Ⅰ的保护功能。小鼠腹腔巨噬细胞用LTA激活,并且同时给予ApoA-Ⅰ处理,37℃培养48小时后,PBS清洗并用4%的甲醛固定15分钟,封闭液处理一小时后加入分别加入NF-κB p65抗体,辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗,置于荧光显微镜下观察,发现与对照组相比,给予ApoA-Ⅰ后LTA诱导的巨噬细胞中NFκB激活和核转位可以被抑制。给小鼠腹腔注射LTA,造成脓毒血症后,尾静脉注射ApoA-Ⅰ进行治疗（对照组注射生理盐水）。观察24小时后,取血和肺灌洗液,测定白介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度。同时,取小鼠肺组织做病理切片,观察组织病理变化。结果表明,ApoA-Ⅰ能够显著降低血浆中IL-1β和TNF-α的水平:对照组中IL-1β和TNF-α的浓度分别为（217.33±19.31） pg/ml和（86.94±20.17）pg/ml,ApoA-Ⅰ治疗组中IL-1β和TNF-α的浓度分别为（86.88±17.58）pg/ml（P＜0.01）和（59.66±20.33）pg/ml（P＜0.05）。同时,ApoA-Ⅰ能够显著降低肺灌洗液中IL-1β和TNF-α的水平:对照组中IL-1β和TNF-α的浓度分别为（182.50±23.24）pg/ml和（69.41±9.81）pg/ml,ApoA-Ⅰ治疗组中IL-1β和TNF-α的浓度分别为（150.25±13.67）pg/ml（P＜0.01）和（45.75±7.57）pg/ml（P＜0.01）。另外,组织病理分析表明,ApoA-Ⅰ可以减轻LTA诱导的小鼠急性肺损伤及炎症反应。上述结果说明ApoA-Ⅰ在LTA诱导的小鼠急性肺损伤中具有良好的治疗作用。将ApoA-Ⅰ和LTA的混合物分别用考马斯亮兰和苏丹黑染色后进行琼脂糖凝胶电泳,发现两种染色均只有同样位置的一条条带,说明ApoA-Ⅰ和LTA在体外也可以直接结合。以上实验结果表明:1、ApoA-Ⅰ在LTA诱导的小鼠系统性炎症和急性肺损伤中具有良好的治疗作用;2、ApoA-Ⅰ在小鼠败血症中具有良好的治疗作用;3、ApoA-Ⅰ可能通过两条途径抑制巨噬细胞激活:（1）细胞外结合并中和LTA,阻断LTA对巨噬细胞的激活;（2）细胞内阻断激活的巨噬细胞的信号传导通路（NFκB的激活和核转位）,抑制炎症介质的释放。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与仪器
• 一、材料与试剂
• 二、实验动物
• 三、仪器
• 实验方法
• 一 冷乙醇沉淀分离ApoA-I
• 二 ApoA-I分离纯化及鉴定
• 2.1 制备ApoA-I的SDS-PAGE鉴定
• 2.2 制备ApoA-I的Western Blot鉴定
• 三 ApoA-I对LTA激活的巨噬细胞细胞毒性的抑制作用
• 3.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离纯化
• 3.2 L-929细胞的培养、传代及冻存
• 3.3 MTT法检测L929细胞杀伤率
• 四 ApoA-I抑制LTA引起的巨噬细胞NF-kB的活化和核转位
• 4.1 样品准备
• 4.2 固定
• 4.3 封闭
• 4.4 一抗孵育
• 4.5 二抗孵育
• 4.6 蛋白检测
• 五 ApoA-I在LTA诱导的小鼠急性肺损伤中的治疗作用
• 5.1 样品的收集和处理
• 5.2 血浆和肺灌洗液中IL-1β和TNF-α浓度的测定
• 5.3 小鼠肺组织病理学检查
• 六 ApoA-I与LTA的体外结合
• 6.1 ApoA-I和LTA样品染色
• 6.2 琼脂糖凝胶电泳
• 七 统计学分析
• 实验结果
• — ApoA-I分离纯化及SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定
• 二 ApoA-I对LTA激活的巨噬细胞细胞毒性的抑制作用
• 三 ApoA-I抑制LTA诱导的巨噬细胞NF-kB的活化和核转位
• 四 ApoA-I在LTA诱导的小鼠急性肺损伤中的治疗作用
• 4.1 血浆和肺灌洗液中IL-1β和TNF-α浓度的测定
• 4.2 小鼠肺组织病理学检查
• 五 ApoA-I与LTA的体外结合
• 实验讨论
• 结论
• 研究方向
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢