编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因（eg Ⅰ）的克隆与表达研究

论文摘要

本论文以草菇Volvariella volvacea V23总RNA为模板,采用RT-PCR法,克隆了包括自身信号肽在内的中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因（egⅠ）的cDNA序列。测序结果表明,cDNA序列全长1167 bp,编码389个氨基酸,推测第1-23位氨基酸为信号肽,第24-389位氨基酸为成熟肽,属于糖苷水解酶第五家族。将EGⅠ成熟肽编码序列克隆进大肠杆菌表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET/ egⅠ,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得了重组菌株BL21/ egⅠ。SDS-PAGE分析表明:EGⅠ在大肠杆菌中实现了胞内表达,分子量约为39.5 kD,但不具有酶活力。将EGⅠ成熟肽编码序列克隆进分泌型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K/ egⅠ,用SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性和产酶能力的筛选,得到了一株高产菌株P. pastoris-EGⅠ1,SDS-PAGE分析表明:EGⅠ在毕赤酵母中实现了分泌表达,分子量约为42 kD,大于39.5 kD的理论分子量,原因可能是表达产物在翻译后修饰时发生了糖基化。对毕赤酵母发酵生产EGⅠ的条件进行了优化,结果显示:在诱导时间为96 h,甲醇诱导浓度为2.0%,最初诱导pH为7.5,BMGY培养基甘油浓度为4.0%,BMMY培养基补加甘油0.75%和表面活性剂吐温20浓度为0.15%时,产酶效率最高,达到4612U/mL。对EGⅠ的部分酶学性质进行了研究,结果显示:酶的最适反应温度为55℃;最适反应pH为7.5;当温度在55℃以下时,酶有很好的温度稳定性,当超过55℃时快速下降,但是到65℃时仍然保存60%的酶活力;在pH6.5-9.0的范围内,酶液有较好的pH稳定性,其酶活力保存90%以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 纤维素简介
• 1.2 纤维素酶研究进展
• 1.2.1 纤维素酶的来源
• 1.2.2 纤维素酶的分子结构
• 1.2.3 纤维素酶的作用机制
• 1.2.4 纤维素酶基因的克隆
• 1.3 纤维素酶的应用
• 1.3.1 食品工业中的应用
• 1.3.2 在饲料工业中的应用
• 1.3.3 在纺织工业中的应用
• 1.3.4 在其它工业中的应用
• 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统简介
• 1.4.1 毕赤酵母的生物学特点
• 1.4.2 毕赤酵母表达宿主菌
• 1.4.3 毕赤酵母的表达载体
• 1.5 研究目的和立题依据
• 1.6 研究内容
• 第二章 中性内切型葡聚糖酶基因的克隆与序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 化学试剂
• 2.2.3 质粒与菌株
• 2.2.4 溶液配制
• 2.2.5 PCR 扩增引物
• 2.2.6 培养基
• 2.3 方法
• 2.3.1 DNA 琼脂糖电泳后的割胶回收
• 2.3.2 大肠杆菌质粒的小量制备
• 2.3.3 大肠杆菌感受态的制备
• 2.3.4 转化感受态大肠杆菌
• 2.3.5 草菇总RNA 提取
• 2.3.6 cDNA 第一条链的合成
• 2.3.7 目的基因的PCR 扩增、克隆和测序
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 草菇总RNA 的提取
• 2.4.2 目的基因的PCR 扩增和克隆
• 2.4.3 草菇中性EG1cDNA 的序列分析
• 2.5 小结
• 第三章 egⅠ在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 化学试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 菌株与质粒
• 3.2.4 PCR 引物
• 3.2.5 培养基
• 3.2.6 SDS-PAGE 凝胶电泳试剂配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 中性内切型EG1 的酶活力测定
• 3.3.2 表达重组蛋白的SDS-PAGE 电泳检测
• 3.3.3 EGⅠ在大肠杆菌中的表达
• 3.3.4 EGⅠ在毕赤酵母中的表达
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 大肠杆菌表达载体的构建
• 3.4.2 大肠杆菌工程菌株的表达产物分析
• 3.4.3 毕赤酵母表达载体的构建
• 3.4.4 毕赤酵母工程菌株的筛选和验证
• 3.4.5 毕赤酵母工程菌株的表达产物分析
• 3.4.6 毕赤酵母工程菌株的稳定性检测
• 3.4.7 G418 抗性与毕赤酵母工程菌株产酶量的关系
• 3.5 小结
• 第四章 egⅠ在毕赤酵母中表达条件的优化和酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 试验仪器
• 4.2.2 化学试剂
• 4.2.3 培养基
• 4.3 方法
• 4.3.1 重组毕赤酵母摇瓶发酵条件的优化
• 4.3.2 粗酶液的酶学性质研究
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 摇瓶发酵条件的优化
• 4.4.2 粗酶酶学性质的研究
• 4.5 小结
• 结论和展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文