苹果α-法尼烯合成酶基因的克隆与表达特性研究

论文题目: 苹果α-法尼烯合成酶基因的克隆与表达特性研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 植物学

作者: 李萌

导师: 张元湖,孟庆伟

关键词: 苹果,虎皮病,法尼烯合成酶,代谢调控,基因表达

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: α-法尼烯是存在于植物体内的次生代谢物。α-法尼烯与昆虫的诱导性有关,是苹果蠹蛾幼虫与成虫的引诱剂;α-法尼烯含量与植物的冷害程度呈正相关;α-法尼烯是诱导虎皮病发生的重要因素。虎皮病是苹果、梨在低温贮藏中后期发生的最严重的生理病害之一,果皮中α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,调控此途径的酶包括3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),法尼基焦磷酸合成酶(FPPS),α-法尼烯合成酶(AFS)。其中AFS是调控α-法尼烯合成的最直接的限速酶,它催化法尼基焦磷酸(FPP)转变为α-法尼烯。近年来,通过基因敲除或反义抑制的方法调控AFS基因的表达,从而调控α-法尼烯合成的研究及解释虎皮病发生的分子机理成为国内外研究的热点问题。本研究根据Genbank 注册的α-法尼烯合成酶基因序列,设计特异引物,从青香蕉苹果果皮中克隆得到AFS 基因的cDNA 片断,研究了其在苹果低温冷藏(0℃)期间及出库后一段时期内AFS 基因的表达与α-法尼烯释放的关系;构建了原核表达载体,在大肠杆菌中表达了该基因;利用农杆菌介导的叶盘法成功转化烟草,并初步对转基因烟草部分光合指标进行了测定。主要结果如下: 1 采用RT-PCR 方法,从苹果果皮中克隆得到了苹果α-法尼烯合成酶基因(AFS)cDNA,该基因编码区全长1728 个碱基,编码576 个氨基酸。在GenBank 注册该基因(登记号为AY563622)。2 序列比较发现该序列与其他品种苹果和梨的α-法尼烯合成酶基因同源性较高,与其它作物如黄瓜、松、杉植物等同源性较低。Southern 杂交结果显示,AFS 基因在苹果基因组中以单拷贝形式存在。3 对苹果冷藏期间AFS 的表达进行的Northern 杂交结果显示,在对照果实中,AFS 基因在冷藏初期表达量较低,到冷藏的第12 周表达量达到最高,随时间延长表达量降低;用新的乙烯抑制剂1-MCP 处理可以抑

论文目录:

中文摘要

英文摘要

1 引言

1.1 苹果中的α-法尼烯

1.1.1 α-法尼烯与虎皮病

1.1.2 α-法尼烯与昆虫诱导

1.2 α-法尼烯的代谢途径

1.3 α-法尼烯代谢的分子调控

1.4 研究的前景及展望

2 材料与方法

2.1 实验材料与处理

2.1.1 植物材料

2.1.2 材料处理

2.1.3 菌株与质粒

2.1.4 酶及生化试剂

2.1.5 PCR引物

2.2 实验方法

2.2.1 CTAB法提取苹果果皮总RNA

2.2.2 RNA反转录

2.2.3 苹果AFS基因cDNA的分离

2.2.3.1 PCR扩增AFS cDNA

2.2.3.2 PCR产物的回收纯化

2.2.3.3 回收片段末端加碱基A

2.2.4 苹果AFS基因的克隆与测序

2.2.4.1 连接反应

2.2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.4.3 转化及克隆筛选

2.2.4.4 碱法小量提取质粒DNA及酶切鉴定

2.2.4.5 酶切鉴定

2.2.4.6 序列测定

2.2.5 Northern杂交

2.2.5.1 RNA 提取

2.2.5.2 甲醛变性胶电泳

2.2.5.3 转膜

2.2.5.4 预杂交

2.2.5.5 探针的制备

2.2.6 Southern杂交

2.2.6.1 基因组 DNA 的提取

2.2.6.2 基因组 DNA 的限制性内切酶消化

2.2.6.3 电泳及转膜

2.2.6.4 预杂交

2.2.6.5 探针制备

2.2.6.6 杂交

2.2.6.7 洗膜及压片

2.2.7 HPLC 检测苹果果皮中的α-法尼烯含量

2.2.8 植物表达载体的构建

2.2.8.1 碱法大量提取质粒DNA

2.2.8.2 载体构建

2.2.9 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备及转化

2.2.9.1 农杆菌感受态细胞的制备

2.2.9.2 冻融法转化农杆菌

2.2.9.3 利用农杆菌介导转化烟草

2.2.10 转基因烟草植株的PCR 检测

2.2.10.1 CTAB 法微量法提取基因组DNA

2.2.10.2 转基因植株的PCR 筛选

2.2.11 转基因植株的检测

2.2.11.1 利用TRIZOL试剂盒提取RNA

2.2.11.2 RNA 反转录

2.2.11.3 PCR 检测

2.2.12 转基因烟草膜脂组分及光合指标测定

2.2.12.1 膜脂组分的测定

2.2.12.2 温度响应曲线的测定

2.2.12.3 材料处理

2.2.12.4 叶片光合参数的测定

2.2.12.5 荧光参数的测定

2.2.12.6 O_2 释放量的测定

2.2.13 原核表达载体构建

2.2.13.1 AFS 编码区基因的克隆

2.2.13.2 表达载体构建

2.2.13.3 AFS 原核表达的诱导

2.2.13.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3 结果与分析

3.1 苹果 AFS 基因的克隆

3.1.1 苹果果皮 RNA 的提取及反转录

3.1.2 AFS基因的分离

3.2 AFS基因的序列分析

3.2.1 AFS基因核甘酸序列以及推导的氨基酸序列

3.2.2 AFS序列同源性比较分析

3.3 基因表达特性分析

3.3.1 苹果AFS 基因 Southern 杂交分析

3.3.2 AFS基因在苹果冷藏不同时期的表达

3.3.3 AFS基因在苹果冷藏出库后不同时期内的表达

3.3.4 苹果果皮中α-法尼烯含量的 HPLC 检测

3.4 AFS 基因正义表达载体的构建及烟草转化

3.4.1 正义表达载体 PBI-AFS 的构建

3.4.2 表达载体pBI-AFS的PCR及酶切鉴定

3.4.3 AFS基因转化烟草及转基因植株的检测

3.4.4 转基因烟草膜脂组分和光合参数分析

3.4.4.1 转 AFS 基因烟草膜脂组分的变化

3.4.4.2 转 AFS 基因烟草光合速率对温度的响应

3.4.4.3 高温胁迫下转 AFS 基因烟草净光合速率的变化

3.4.4.4 高温胁迫下转 AFS 基因烟草最大光化学效率的变化

3.4.4.5 高温胁迫对转 AFS 基因烟草实际光化学效率的影响

3.4.4.6 高温胁迫下转 AFS 基因烟草 O_2释放的变化

3.5 AFS基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中诱导表达

3.5.1 AFS基因原核表达载体的构建

3.5.2 原核表达载体pET-AFS的PCR及酶切鉴定

3.5.3 AFS在大肠杆菌中的诱导表达

4 讨论

4.1 苹果 AFS 基因及其同源基因之间的序列分析

4.2 苹果 AFS 基因的表达特征

4.3 AFS基因在转基因烟草中的表达分析

4.4 AFS基因在大肠杆菌中的表达分析

4.5 进一步研究的设想

5 结论

参考文献

附录1

附录2

致谢

硕士期间发表及待发表文章

发布时间: 2005-10-11

参考文献

[1].基于机器视觉的苹果分级方法研究[D]. 刘新庭.湖南农业大学2015
[2].江苏丰县苹果生产现状及发展对策[D]. 黄善峤.南京农业大学2012
[3].安塞山地苹果产业发展与苹果文化的建设[D]. 耿海艳.西北农林科技大学2013
[4].延安市苹果产业发展研究[D]. 张永祥.西北农林科技大学2013
[5].黄土高原有机苹果生产标准化研究[D]. 米宏彬.西北农林科技大学2008
[6].中小型苹果采后贮藏生理特性的研究[D]. 罗桂杰.东北农业大学2008
[7].计算机视觉在苹果外部品质检测与分级方面的应用研究[D]. 袁金丽.中国农业大学2005
[8].苹果内部品质无损检测极弱信号放大与信号传输系统设计[D]. 赵冕.西北农林科技大学2017
[9].环剥和倒贴皮对苹果树营养调控机理研究[D]. 杨阿丽.甘肃农业大学2016
[10].临猗苹果与烟台苹果的产业化比较分析[D]. 王京.山西农业大学2013

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