禽流感病毒M2e、NP多表位抗原的制备及其免疫原性的初步研究

论文摘要

高致病性禽流感（HPAI）是由H5和H7亚型禽流感病毒（AIV）引起的禽类急性高致病性传染病,被国际兽疫局（OIE）列为A类疾病,在我国被列为一类传染病。禽流感病毒基质蛋白2（M2）是流感病毒的外膜蛋白之一,氨基酸序列高度保守,在各个亚型流感病毒间同源性很高。禽流感病毒核蛋白（NP）是病毒粒子的内部结构蛋白,至少含有三个以上独立的抗原位点,是细胞毒性T细胞主要的抗原位点。作为抗原,它们都可以诱导产生保护性免疫应答,并具有一定程度的交叉保护力,因此是研究流感通用疫苗的理想抗原。以本实验室构建保存的质粒pET-3M2e和pBV-M2e-Fc为模板,并在引物上引入NP抗原表位（NP1、NP2）,经PCR扩增后得到基因片段3M2e-NP1、NP2-Fc、3M2e-NP1/2。人工合成乙肝表面抗原（HBsAg）和破伤风类毒素（TT）的两个通用型T细胞抗原表位PTCEs。将以上基因片段串联起来克隆至原核表达载体pET-32α（+）,构建表达载体pET32α-3M2e-NP1/2-Fc、pET32α-3M2e-NP1/2、pET32α-PTCE-3M2e- NP1/2,转化至大肠杆菌BL21-DE3,经IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明,构建的三种表达载体经过酶切鉴定和测序,证实其插入的片断大小、读码框架正确。所表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量分别约为50kDa、31.2kDa、36.2kDa,通过镍亲和层析纯化能够得到条带单一的电泳纯蛋白,经Western-blotting鉴定为阳性,为进一步进行其免疫原性的研究奠定了基础。利用大肠杆菌表达的3M2e-NP1/2-Fc、3M2e-NP1/2及PTCE-3M2e-NP1/2三种蛋白,结合弗氏、白油、壳聚糖、CpG等佐剂,免疫20日龄的非免鸡,首免后每周定期采血,以实验室建立的ELISA方法检测抗M2e抗体水平,在MDCK细胞上检测血清与M2的结合能力,在SPF鸡胚上测定抗血清的中和效价,以流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数量的变化。结果发现,免疫后各组均能检测到ELISA抗体水平,其中融合蛋白PTCE-3M2e-NP1/2配合弗氏佐剂产生的抗体水平最高,各免疫组在二免后的第四周左右抗体达到高峰。免疫荧光显示免疫组的抗血清能够跟病毒表达在细胞表面的M2特异性结合,但在鸡胚上血清有一定的中和能力。流式细胞仪检测显示外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例在免疫后均有不同程度的升高（P<0.05）,具有细胞免疫的特征。构建的嵌合肽抗原具有较好的免疫原性,但免疫保护效果需要到有资质的机构进行验证。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 禽流感病毒基质蛋白、核蛋白研究进展
• 1 禽流感病毒基质蛋白2 的研究进展
• 1.1 M2 蛋白基因及分子结构特征
• 1.2 M2 蛋白在病毒复制中具有重要作用
• 1.3 M2 蛋白是重要的病毒抗原，在疫苗发展中具有重要意义
• 1.4 M2 蛋白诱导的保护性免疫应答的作用机理研究
• 2 禽流感病毒核蛋白（NP）的研究进展
• 2.1 NP 基因保守性的研究
• 2.2 NP 对AIV 复制及感染能力的影响及免疫学功能研究
• 3 小结和展望
• 参考文献
• 研究一 禽流感病毒M2E、NP 基因与辅助基因的串连表达、纯化及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 基目的因的PCR 扩增
• 2.2 基因片段的串联
• 2.3 原核表达载体的构建
• 2.4 表达融合蛋白的SDS-PAGE
• 2.5 诱导条件的优化
• 2.6 表达蛋白纯化后的SDS-PAGE
• 2.7 Western-blotting 检测
• 3 讨论
• 3.1 M2 离子通道的表达
• 3.2 目的基因的串联
• 3.3 原核表达载体的选择
• 参考文献
• 研究二 重组禽流感病毒M2E、NP 多表位嵌合肽免疫原性的初步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 抗体滴度测定
• 2.2 H9N2 亚型禽流感病毒含量
• 2.3 间接免疫荧光试验
• 2.4 鸡胚中和试验
• 2.5 细胞病变抑制试验
• +、CD8⁺ T 淋巴细胞的亚类的动态变化'>2.6 外周血CD4⁺、CD8⁺ T 淋巴细胞的亚类的动态变化
• 3 讨论
• 3.1 嵌合肽的免疫原性
• 3.2 嵌合肽诱导的体液免疫
• 3.3 嵌合肽诱导的细胞免疫
• 参考文献
• 附：载体构建流程图
• 致谢