草原龙胆抗盐相关基因表达谱分析及BADH基因的遗传转化

草原龙胆抗盐相关基因表达谱分析及BADH基因的遗传转化

论文摘要

草原龙胆(Eustoma grandiflorum)属龙胆科草本植物,是流行的鲜切花材料,具有一定的耐盐性,是一种具有重要经济价值的研究材料。为了研究草原龙胆的抗盐机理,分离抗盐相关基因,提高其抗盐水平,进行了以下三方面的研究:1草原龙胆盐抗性相关基因的筛选为了分离草原龙胆盐抗性相关基因,以NaCl 400 mmol/L处理的草原龙胆叶片为tester,清水处理的对照为driver,制作了盐胁迫抑制差减(SSH)文库。经过序列测定以及序列分析,获得了658条非重复序列。通过GO(Gene Ontology)的分子功能、生物学途径及细胞组件三方面的分析,获得了123条序列的注释,占总序列的19%。在生物学途径中分为:有丝分裂检查点、类泛素化蛋白修饰、氧化胁迫反应、转运、电子传递等14类;分子功能中分为过氧化氢酶活性、催化活性、环氧化物酶活性、单氧化酶活性、谷胱甘肽脱氢酶活性等21类;在细胞组件中分为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞核等10类。2草原龙胆盐胁迫基因表达分析为了研究草原龙胆在盐胁迫条件下的基因表达谱,以构建的SSH文库制作了基因芯片。提取NaCl 600 mmol/L处理3 h草原龙胆的叶片以及清水处理的对照mRNA,经反转录后分别进行了Cy3和Cy5的标记,进行了芯片杂交。杂交数据利用limma软件包进行了数据标准化,分析获得了差异表达基因。结果显示,显著上调表达的基因为14条,显著下调的基因为16条。其中功能已知的序列为5条,分别为硫氧还蛋白、类泛素化蛋白、苏氨酸转运蛋白、脱氢抗坏血酸还原酶、细胞色素P450。3草原龙胆BADH基因的遗传转化为了提高草原龙胆的盐抗性,对草原龙胆进行了BADH基因的遗传转化。从拟南芥中克隆了BADH基因的编码区全长,经过测序验证正确后,将其构建到了植物表达载体pH2GW7,0上。表达载体转化农杆菌LBA4404后制备了农杆菌侵染菌株。通过农杆菌介导法转化草原龙胆,获得了1个转化株系。PCR和Southern杂交检测表明,目的基因已经整合到了草原龙胆基因组中。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  • 1.1 引言
  • 1.2 植物的耐盐机理研究
  • 1.2.1 渗透调节
  • 1.2.2 离子调节
  • 1.2.3 解毒系统
  • 1.2.4 信号转导
  • 1.3 植物基因组学研究
  • 1.3.1 结构基因组学
  • 1.3.2 功能基因组学
  • 1.4 基因分离和表达研究技术
  • 1.4.1 抑制差减杂交技术
  • 1.4.2 基因芯片技术
  • 1.5 植物耐盐基因工程
  • 1.5.1 植物的遗传转化研究
  • 1.5.2 甜菜碱醛脱氢酶基因工程研究
  • 1.6 研究的目的和意义
  • 2 通过 SSH 技术筛选草原龙胆盐抗性相关基因
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 试验材料
  • 2.2.2 试验方法
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 总 RNA 的质量检测
  • 2.3.2 mRNA 的纯化
  • 2.3.3 Rsa Ⅰ酶的消化
  • 2.3.4 二次 PCR 扩增产物的纯化
  • 2.3.5 差减文库的质量检测
  • 2.3.6 序列测定及分析
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 生物学途径分析
  • 2.4.2 分子功能分析
  • 2.4.3 细胞组件分析
  • 2.5 本章小结
  • 3 利用基因芯片对草原龙胆盐胁迫基因表达分析
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 试验材料
  • 3.2.2 试验方法
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 文库克隆 PCR 产物纯化电泳检测
  • 3.3.2 RNA 的质量检测与浓度测定
  • 3.3.3 cDNA 微阵列杂交扫描
  • 3.3.4 cDNA 微阵列杂交数据分析
  • 3.4 讨论
  • 3.5 本章小结
  • 4 草原龙胆 BADH 基因遗传转化
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 试验材料
  • 4.2.2 试验方法
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 总 RNA 质量检测
  • 4.3.2 BADH 基因 CDS 全长的克隆
  • 4.3.3 含 BADH 基因植物表达载体的构建结果
  • 4.3.4 转基因植株的获得
  • 4.3.5 转基因植株的检测
  • 4.4 讨论
  • 4.5 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢
  • 相关论文文献

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