论文摘要
胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,其生长迅速,在脑内呈浸润性生长,无明显界限,手术很难完全切除;化疗和放疗既不能高度特异性地杀伤胶质瘤细胞,又可能产生中枢神经系统乃致全身不能耐受的毒、副反应,预后不良。迄今为止,尽管脑胶质瘤的常规治疗方法中,某些方面有所进展,但疗效仍不尽人意;恶性胶质瘤的平均生存期仅0.6～0.7年。目前,对于脑胶质瘤的发生和发展机制还不是很清楚。因此,研究其分子生物学机制,可为人脑胶质瘤的治疗提供新的思路及更有效的治疗靶点。提高脑胶质瘤治疗效果是目前神经外科学界正着力解决的问题。随着分子生物学的发展,人们提出了一些新的治疗方法,特别是基因治疗引起了人们的极大注意。基因疗法是一种全新概念的治疗方法,它根据瘤细胞与正常细胞内分子机制的不同而设计选择性的使目的细胞死亡的治疗方法。研究发现,iNOS参与了胶质瘤的血管生成、增殖与凋亡等过程。因此,针对iNOS的“靶点治疗”,可能是胶质瘤综合治疗的一条新途径。本研究探讨iNOS、VEGF和PCNA等基因在人脑胶质瘤发生发展过程中作用机制,应用分子克隆技术构建了携带反义诱导型一氧化氮合酶基因片断的重组腺病毒载体,并将重组腺相关病毒载体分别转染到C6胶质瘤细胞株和大鼠脑胶质瘤动物模型中,从体外和体内探讨iNOS反义RNA基因对脑胶质瘤细胞生长增殖的影响,为反义技术在胶质瘤基因治疗中提供了理论依据。一、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、血管内皮生长因子（VEGF）和增殖细胞核抗原（PCNA）在脑胶质瘤中的表达特点目的:探讨iNOS、VEGF和PCNA等基因在人脑胶质瘤标本表达特点及其三者之间相关性。方法:收集93例人脑胶质瘤（低度恶性组49例,高度恶性组44例）和新鲜脑组织14例（对照组）,应用免疫组化SP法测定iNOS、VEGF、PCNA抗原和Ⅷ-RAg的表达水平并分析其相关性,半定量RT-PCR法分析iNOS、VEGF和PCNA mRNA表达水平,Western Blot法测定iNOS、VEGF和PCNA mRNA蛋白的表达水平。结果:免疫组化结果显示:iNOS在正常脑组织组细胞中不表达,低度恶性组胞浆中呈阳性表达,而高度恶性组呈强阳性表达,二组之间表达强度差异具有统计学意义（P <0.05）;VEGF、PCNA和Ⅷ-Rag在正常脑组织组和胶质瘤组细胞胞浆均有表达,其中,正常脑组织均弱阳性表达,低度恶性组均呈阳性表达,而高度恶性组均呈强阳性表达,三组之间表达强度差异均具有统计学意义（P <0.05）。根据免疫组化结果进行各种抗原表达相关性分析,iNOS、VEGF和PCNA抗原和Ⅷ-Rag在低度恶性组和高度恶性组中表达均具有相关性。半定量RT-PCR法测定结果显示:iNOS mRNA在正常脑组织组细胞中不表达;在低度恶性组表达呈阳性,而高度恶性组表达明显阳性增高,二组之间表达强度差异具有统计学意义（P <0.05）;VEGF和PCNA mRNA在正常脑组织组中低表达,在低度恶性组表达呈阳性,而高度恶性组表达阳性明显增高,三组之间表达强度差异均具有统计学意义（P <0.05）。Western Blot法测定结果显示:iNOS蛋白在正常脑组织组细胞中不表达;在低度恶性组表达呈阳性,而高度恶性组表达明显阳性增高,二组之间表达强度差异具有统计学意义（P <0.05）;VEGF和PCNA蛋白在正常脑组织组中均低表达,在低度恶性组表达均呈阳性,而高度恶性组表达阳性均明显增高,三组之间表达强度差异均具有统计学意义（P <0.05）。结论: iNOS、VEGF和PCNA和Ⅷ-Rag共同参与肿瘤发生发展过程,四种基因表达强度与胶质瘤细胞恶性度相关,恶性度越高,表达量越多,同时,四种基因在胶质瘤发生发展过程发挥相互作用,共同介导肿瘤细胞生长增殖过程。二、诱导型一氧化氮合酶反义RNA重组腺相关病毒载体（rAAV-AsiNOS）构建目的:构建携带反义诱导型一氧化氮合酶基因片断的重组腺病毒载体（rAAV-AsiNOS）,并对其滴度进行测定。方法:应用RT-PCR技术扩增iNOS目的基因片断,Sal I和Hind III内切酶分别双酶切pAAV-MCS质粒和iNOS基因,经过胶回收和纯化后,在T4连接酶作用下,构建rAAV-AsiNOS重组质粒,并转化到感受态细菌XL-10中,并进行鉴定和测序,293细胞病毒包装,重组腺相关病毒载体大量扩增,滴度和感染率的测定以及浓缩和纯化。结果: RT-PCR扩增iNOS特异性片段大小342bp;经双酶切和连接成重组质粒rAAV-AsiNOS;酶切鉴定结果显示重组质粒rAAV-AsiNOS后酶切产物是二条特异性片段大小分别为361和3400bp;基因测序结果显示iNOS基因片段反向克隆到pAAV的MCS,成功地构建携带反义iNOS基因的重组质粒rAAV-AsiNOS,显示构建成功;经测算病毒原液的滴度为6～12×107个/ml ,对PC12细胞的感染率约为70%;分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体,获得较高的病毒滴度,约2×1010个病毒颗粒/ml,去除腺病毒等影响因素。结论:成功构建携带iNOS反义基因的腺相关病毒载体,测序证实iNOS基因片断反向克隆到的腺相关病毒载体上;证实重组腺相关载体能够转染PC12细胞,转染率为70%。三、重组腺相关病毒载体rAAV-AsiNOS抑制大鼠C6胶质瘤细胞生长增殖的实验研究目的:探讨携带iNOS反义RNA重组腺相关病毒载体对胶质瘤细胞生长增殖的影响以及对iNOS、VEGF和PCNA等基因表达的影响。方法:根据C6细胞培养基成分不同分为三组,即空白组（10 %胎牛血清的DMEM培养液）、rAAV-LacZ组（含有rAAV-LacZ的10 %胎牛血清的DMEM培养液）和rAAV-AsiNOS组（含有rAAV-AsiNOS的10 %胎牛血清的DMEM培养液）,观察三组中C6细胞生长曲线;三组同时进行培养1h、3h、6h、12h和24h,应用流式细胞仪（FCM）检测C6细胞中NT阳性细胞百分比、细胞凋亡率和iNOS、VEGF和PCNA阳性细胞百分比,应用半定量RT-PCR分析iNOS、VEGF和PCNA mRNA表达。结果:一定感染复数的重组病毒载体rAAV-LacZ对C6胶质瘤细胞生长趋势无明显影响,而rAAV-AsiNOS重组病毒载体在转染C6细胞从3d开始出现C6细胞生长缓慢,与对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）。FCM检测结果显示,C6胶质瘤细胞在含有重组病毒载体AAV-AsiNOS培养基中培养3h开始,NT阳性细胞百分比较对照组和AAV-LacZ组的明显增加,二者之间差异有统计学意义（P <0.05）;同一培养时间中,不同组别中C6胶质瘤细胞凋亡率均不一致,从培养3h开始,rAAV-AsiNOS组凋亡率明显高于对照组和rAAV-LacZ组的凋亡率,与二组之间差异均有统计学意义（P <0.05）,iNOS、VEGF和PCNA阳性细胞在不同组别中均有不同程度百分比值,其中,对照组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义（P >0.05）;而rAAV-iNOS组从培养3h开始出现iNOS、VEGF和PCNA阳性细胞百分比下降,较对照组之间差异均有统计学意义（P <0.05）。半定量RT-PCR分析分析结果显示,iNOS、VEGF和PCNA mRNA在不同组别中均有不同程度表达,同一时间中,对照组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义（P >0.05）;而rAAV-iNOS组从培养6h开始出现iNOS、VEGF和PCNA mRNA表达下降,较同一时间对照组之间差异有统计学意义（P <0.05）。结论:携带iNOS反义RNA腺相关病毒载体rAAV-iNOS,能够抑制C6胶质瘤细胞生长增殖,能够抑制iNOS表达,从而通过抑制VEGF和PCNA基因发挥抗胶质瘤细胞生长增殖的重要作用。四、重组腺相关病毒载体rAAV-AsiNOS抑制大鼠脑C6胶质瘤生长增殖的实验研究目的:建立SD大鼠脑胶质瘤模型,探讨重组病毒载体rAAV-AsiNOS在体内抑制大鼠脑C6胶质瘤生长增殖以及对iNOS、VEGF和PCNA等基因表达的影响。方法:采用立体定向技术将C6胶质瘤细胞接种于SD大鼠的右侧尾状核区,建立大鼠脑胶质瘤模型,造模7d后根据注入肿瘤内物质不同分为对照组（生理盐水）、rAAV-LacZ组（重组腺相关病毒载体rAAV-LacZ）和rAAV-AsiNOS组（重组腺相关病毒载体rAAV-iNOS）,设立空白组（只进行类似立体定向开颅手术但未接种C6细胞）,共四组,每组8只SD大鼠。各组于造模前（第1天）、造模后7d（第8天）和转染7d（第15天）分别进行神经功能缺失评分;于造模后7d和转染7d接受MR平扫及增强检查;于转染7d测定大鼠脑胶质瘤重量和体积,观察胶质瘤细胞超微结构,免疫组化检查大鼠C6胶质瘤中iNOS、VEGF和PCNA抗原的表达,半定量RT-PCR分析大鼠脑胶质瘤中iNOS、VEGF和PCNA mRNA表达水平。结果:在只转染生理盐水和对照载体rAAV-LacZ后的荷瘤大鼠神经功能缺失均加重,转染重组载体rAAV-iNOS后的荷瘤大鼠神经功能缺失改善。MR扫描结果显示对照组和rAAV-LacZ组大鼠脑胶质瘤在第15天均明显大于第8天的病灶,明显的占位效应,肿瘤向周围脑组织呈浸润性生长,而rAAV-iNOS组颅内病灶明显缩小,部分坏死。电镜观察发现对照组和rAAV-LacZ组中的胶质瘤细胞形态和细胞核不规则,核异染色质增加或核异常分裂,但是rAAV-AsiNOS组中出现凋亡小体。免疫组化和半定量RT-PCR结果显示在对照组、rAAV-LacZ组和rAAV-iNOS组等大鼠脑胶质瘤标本中的iNOS、VEGF和PCNA抗原以及iNOS、VEGF和PCNA mRNA均有表达,但是rAAV-iNOS组中三种基因表达比对照组和rAAV-LacZ组均明显下降,之间差异均有统计学意义（P <0.05）。结论:携带iNOS反义RNA腺相关病毒载体rAAV-iNOS,能够抑制大鼠脑胶质瘤中iNOS表达,调控VEGF合成,减少胶质瘤血管形成,抑制胶质瘤生长增殖,降低PCNA表达,解除iNOS抑制肿瘤细胞凋亡作用,发挥体内抗胶质瘤机制。