论文摘要
随着人类社会的老龄化,脑部疾病的发病率呈逐年上升的趋势,已成为危害人类生命和健康的主要疾病之一。阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）即俗称的老年性痴呆是四大常见的神经退行性疾病之一,目前,越来越庞大的人群正经受着阿尔茨海默病的困扰,却依然没有十分有效的治疗手段。近年来的研究发现,多种多肽蛋白药物具有神经保护作用,可望防治老年性痴呆,因此,多肽蛋白类药物的研究为其治疗带来新希望。近年来,鼻腔给药的脑靶向研究为提高多肽蛋白类药物的脑内递释提供新思路。鼻脑通路可以绕过BBB直接入脑,研究表明,药物经鼻给药后,既可经嗅通路吸收入脑,分布到嗅相关脑组织或脑脊液流经区域；又可经三叉神经通路吸收入脑,迅速分布到各脑组织,包括脑干、小脑、脊髓等远离鼻腔的部位,为蛋白多肽类药物脑内递释提供了可能。但是该类药物经鼻吸收后,存在易被鼻腔内酶代谢,透鼻粘膜吸收差以及鼻腔快速清除等不利因素影响其向脑部的递释。在过去的二十年中,聚乙二醇修饰的纳米粒吸引了越来越多制剂研究者的关注。其具有较好的生物相容性、可生物降解性和体内长循环行为；尤其值得一提的是将多肽类药物包载在纳米粒中能避免药物的降解、提高稳定性。然而,该类纳米给药系统的鼻腔应用仍存在着问题：表面聚乙二醇链的修饰虽然能减少纳米粒被体内单核吞噬细胞系统的摄取,延长循环时间,但另一方面也显著削弱了靶细胞与纳米递释系统的相互作用。乳铁蛋白（Lactoferrin, Lf）是一种存在于哺乳动物体内的阳离子糖蛋白,已有研究证实Lf受体不仅在呼吸道上皮细胞基顶部和脑细胞（如脑毛细血管内皮细胞和神经元细胞等）高表达,而且在神经中枢系统中与年龄相关的退行性疾病如AD,帕金森氏病,亨廷顿氏病和肌萎缩性侧索硬化相关的区域也呈高表达。我们推测Lf可以作为构建经鼻入脑递药系统的合适配体。为此,本课题构建了一种新型的可生物降解的经鼻入脑纳米递释系统——乳铁蛋白修饰聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）纳米载药系统（Lf-NP）,以期提高系统的经鼻给药脑靶向递释效果,并系统评价脑内递药特性,同时考察其包载多肽蛋白类药物的药效学。本研究第一章以马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯（Maleimide-PEG-PCL）和甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯·（MPEG-PCL）为材料,采用复乳溶媒蒸发法制备纳米粒（NP）,然后通过其表面马来酰亚胺基与巯基化的Lf共价连接而制备Lf-NP,并对其进行表征。所制备的NP平均粒径在70-90 nm左右,Zeta电位在-24mV左右,表面元素分析证实了Lf成功连接在了NP表面。利用CBQCA蛋白定量试剂盒法测得每个Lf-NP表面连接的Lf约为46个,Lf的连接效率为22.6%。以粒径为指标,最终筛选的优化制备条件为：聚合物总量25 mg,Maleimide-PEG-PCL和MPEG-PCL的最优质量比为1：9左右,巯基化试剂2-IT与Lf的摩尔比为40：1；马来酰亚胺基与巯基化的Lf连接反应时间为9 h。本研究第二章以6-香豆素作为NP的荧光探针,采用16HBE14o-细胞作为细胞模型,以未连接Lf的NP为对照,对Lf-NP的鼻粘膜细胞摄取特性进行了评价。在pH 7.0和4.0的条件下,6-香豆素在NP和Lf-NP中24 h的累积泄漏量均小于3.5%,证实6-香豆素是一种较为理想的NP探针,能较为准确地示踪纳米粒体外生物学行为。定性摄取实验和高内涵定量摄取实验结果表明,16HBE14o-细胞对Lf-NP的摄取呈浓度、时间依赖性,但在较高浓度和长时间孵育后呈饱和趋势。细胞摄取抑制实验结果表明,16HBE14o-细胞对Lf-NP的摄取过程是一个与能量相关的包被凹陷（clathrin）内吞和穴样凹陷（caveolae）内吞混合作用结果。且预先给予Lf孵育后,Lf-NP在16HBE14o-细胞的摄取量降低,证明Lf-NP的细胞内吞为Lf受体介导的内吞过程。细胞摄取实验证明,与NP相比,Lf-NP在鼻粘膜细胞上具有很高的摄取效率,预示Lf介导的纳米粒有着更高的经鼻入脑效率。本研究第三章分为两部分,第一部分定性考察了荧光标记的Lf经鼻入脑递送特性,第二部分采用药动学方法定量考察了Lf-NP大鼠鼻腔给药后的脑内各组织的分布特征。第一部分采用近红外荧光染料Cy5.5分别标记Lf和阴性对照一牛血清白蛋白（BSA,鼻腔和脑部不表达BSA受体）,将荧光标记的Lf和BSA分别经大鼠鼻腔给药后,采用活体成像技术考察了其在脑部的经时蓄积,研究结果表明,Lf可以经鼻腔进入脑部,具有一定的脑靶向性。第二部分以6-香豆素为荧光探针,以NP作为对照,采用药动学方法考察了载荧光探针6-香豆素的Lf-NP大鼠鼻腔给药后的脑内各组织的分布特征。结果发现,NP经Lf修饰后,其入脑量有较大提高,在嗅球、嗅区、大脑（不含海马组织）、小脑及海马五个部分6-香豆素浓度均显著高于NP组。载于Lf-NP中的6-香豆素在嗅球、嗅区、大脑（不含海马组织）、小脑及海马中的AUCo-8h 分别为NP的2.57,2.70,2.22,2.70和2.23（P<0.001）倍,且Lf修饰的NP组在嗅球、嗅区、大脑（不含海马组织）、小脑及海马中的脑内靶向效率（Drug targeting efficiency,DTE）分别2.69,2.27,3.80,3.57和3.51,均显著高于同组织的NP组DTE （P<0.001）,说明Lf-NP具有较好的经鼻给药后的脑靶向效果。通过Lf-NP鼻腔给药后入脑机理的研究发现纳米粒经鼻入脑的转运可能是通过非神经轴浆转运机制入脑,同时包括嗅通路和三叉神经通路。第四章构建了AD小鼠模型,以NAP为模型药物,对Lf-NP的药效学进行了初步的考察。我们首先利用双侧海马定位注射p淀粉样蛋白1-40（Aβ1-40）聚集肽联合鹅膏蕈氨酸（ibotenic acid,IBO）构建小鼠AD模型。随后通过Morris水迷宫行为学实验,小鼠海马乙酰胆碱转移酶（ChAT）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活力以及组织切片三方面评价六种NAP制剂—低剂量NAP溶液组（0.05μg/只）,高剂量NAP溶液（0.1μg/只）组,低剂量包载NAP的NP （NP-NAP）组（0.05μg/只）,高剂量NP-NAP（0.1μg/只）组,低剂量的包载NAP的Lf-NP （Lf-NP-NAP）组（0.05μg/只）和高剂量的Lf-NP-NAP组（0.1μg/只）对于AD小鼠学习能力及空间记忆障碍的治疗和改善作用。根据行为学研究,生化指标和组织切片结果表明,双侧海马定位注射Aβ140聚集肽联合IBO脑室内注射后,小鼠的学习和记忆能力下降,各项生化指标与正常水平有显著差异,出现神经元损伤,说明造模成功。NAP溶液组鼻腔给药后空间记忆障碍和生化指标的改善十分有限,即使给药剂量提高1倍（0.1μg/只）,对于记忆能力以及生化指标的改善作用仍然不够理想,这可能是由于NAP短肽容易被鼻腔内的蛋白酶降解,且受到鼻腔粘膜的低透过性和快速的黏膜纤毛清除率的影响。而NP-NAP组小鼠相对NAP溶液组鼻腔给药后记忆改善作用有所提高,但即使对于高剂量组,其空间记忆障碍和神经损伤的改善作用仍不理想。而Lf-NP-NAP组在低剂量下（0.05μg/只）,已经能够产生明显的空间记忆改善作用,而将剂量提至0.1μg/只时,能显著降低小鼠脑内海马区AChE的含量,提高ChAT含量,各项指标与正常小鼠无显著性差异。这可能是由于Lf-NP能显著提高NAP脑内递送的效率,因而更好的起到治疗和改善的效果。综上所述,Lf-NP是一种新颖、高效、便捷的鼻-脑靶向递药系统,为多肽蛋白类药物的脑内递送提供了新思路,具有较高的应用价值。