小分子与DNA凸起结构的作用和高效DNA酶的筛选

论文摘要

DNA是一类重要的生物大分子,其基本功能是作为遗传信息的载体,并起复制、转录遗传信息的功能。发现对核酸、蛋白质等生物功能体系的生理过程具有调控作用的小分子,并以此为探针,研究小分子与生物靶分子的相互识别、相互作用和信息传递以及药物与疾病的关系等具有广泛的应用前景。凸起结构是DNA识别的一个重要主题。它的额外的没有配对的核苷能够与核酸结合蛋白形成复合物,也能作为小分子化合物的结合位点。核酸凸起结构在核酸的蛋白质识别、移码突变、修复酶的非正常同源重组、反义RNA的生成、DNA三联子重复序列的延伸合成等生物过程中具有重要的生物学意义。我们利用荧光光谱研究了R/S联萘酚氨基糖与不同核酸序列的结合能力,表明了与DNA凸起结构的结合能力;利用紫外光谱、圆二色光谱和SPR等检测方式研究了吩噻嗪氨基糖与不同核酸序列的结合能力,研究结果表明与含有三个碱基凸起结构的DNA序列的结合能力最强。利用SPR的方法,我们同样得到了R/S联萘酚氨基糖和吩噻嗪氨基糖与含有ATT三碱基凸起结构的DNA序列的解离常数。DNA凸起结构的结合分子对三联子重复序列的体外复制具有刺激作用。我们利用三联子重复序列的体外复制体系,发现R/S联萘酚氨基糖、吩噻嗪氨基糖、顺式/反式偶氮苯氨基糖等对重复序列的复制具有不同程度的刺激作用。反式偶氮苯氨基糖对反应具有促进作用,而紫外光照后的顺式偶氮苯氨基糖对反应具有抑制作用。利用吩噻嗪氨基糖,对其他几种单碱基重复序列,二联和三联重复序列在DNA聚合酶ⅠKlenow片段催化下的滑移合成进行了探讨。在吩噻嗪氨基糖化合物存在下,所有序列的滑移复制均被促进。具有较不稳定二级结构的序列均比具有形成稳定二级结构的重复序列束滑出的产物更长。在不同的DNA聚合酶的催化下都能够进行滑移合成。利用DDI化合物检测了不同长度的模板序列,非重复序列和反应温度等对三联子重复序列体外复制扩增的影响。发现一定的反应时间内,短的重复序列作为模板时更容易通过扩增得到较长的产物。非重复序列能改变了重复序列的连续性,能够影响体外复制。升高反应温度有利于滑移的进行。将吩噻嗪氨基糖、R/S联萘酚氨基糖、不同构型的DDI和一个新制癌菌素氨基糖在同样的反应条件下用于ATT/AAT重复序列的体外复制,发现小分子化合物对滑移的促进能力不同。其中吩噻嗪氨基糖的效果最弱,R型联萘酚和新制癌菌素氨基糖的效果相对最强。比较不同的小分子化合物与凸起结构和滑移促进能力,将有助于研究重复序列的滑移机制和靶向凸起结构的小分子的设计。DNA酶是具有催化活性的单链DNA,通常是通过体外分子进化技术得到的。这种筛选同自然界的筛选是相似的,只是加速了筛选的时间过程。为了能够被复制,这些分子必须能够表现出想要得到的催化功能,这样就能把这种分子与其他的分子分开。筛选得到的分子通过聚合酶链式反应进行放大。目前已知的DNA酶能够催化许多的化学反应,包括RNA切割,DNA连接和卟啉氧化等。但是它们的催化能力,通常比蛋白酶的催化能力低几倍。考虑到一个典型的体外筛选实验,一轮的筛选过程只需要随机序列来进行单一底物的操作,如果一个DNA随机序列库在一个短的时间内要催化超过一个反应,只有那些具有高的催化活性,能够多轮催化的核酸酶才能被筛选出来。我们挑选能够进行RNA切割的DNA酶作为模型实验,使用一个含有三臂的RNA作为底物,通过筛选得到的DNA酶在短时间内催化三个RNA切割反应。这样得到的DNA酶将具有更高的酶活性。我们从一个200 pmol的N60的随机序列起始,随机序列的两端各有一段固定序列。利用一个寡核苷酸链作为模板将DNA随机序列与三臂RNA底物进行连接,具有酶活性的DNA切割后产生短的产物。将分离得到的短的产物利用聚合酶链式反应放大后再次进行筛选,进过12的筛选后得到具有RNA切割活性的DNA酶。DNA酶的活性中心的产生同样含有凸起结构和发卡结构,小分子化合物对凸起结构的结合可能影响DNA酶的结构对酶的活性产生调控作用。设计和合成靶向凸起结构的小分子化合物,能够对某些含有凸起结构的生理过程产生调控,具有十分重要的生物学意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 第一部分 小分子化合物与DNA凸起结构的作用
• 第一章 引言
• 1.1 DNA结构
• 1.1.1 DNA的二级结构
• 1.2 核酸凸起结构
• 1.3 小分子与DNA的相互作用
• 1.3.1 小分子与DNA的作用方式
• 1.3.2 小分子与DNA相互作用的研究方式
• 1.4 Triplet repeat序列体外复制
• 1.4.1 以质粒DNA为模板研究DNA聚合酶的暂停（pause）现象
• 1.4.2 Triplet repeat寡合苷酸的体外复制
• 1.4.3 小分子化合物对Triplet repeat寡合苷酸体外复制的影响
• 第二章 小分子与DNA凸起结构的结合作用
• 2.1 实验试剂及仪器
• 2.1.1 溶液及其配制
• 2.1.2 分析仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 含有凸起结构的寡核苷酸的设计、合成、纯化、定量
• 2.2.2 熔炼温度的测定
• 2.2.3 圆二色谱的测定
• 2.2.4 荧光光谱的测定
• 2.2.5 SPR测定
• 2.3 实验结果及讨论
• 2.3.1 联萘酚氨基糖化合物与核酸凸起结构的选择性结合测定
• 2.3.2 吩噻嗪氨基糖化合物与核酸凸起结构的选择性结合测定
• 2.3.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 小分子对triplet repeat体外复制的调控
• 3.1 实验试剂及仪器
• 3.1.1 溶液及其配制
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 生物酶类
• 3.1.4 其他
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 寡合苷酸的标记
• 3.2.2 寡合苷酸的退火
• 3.2.3 体外复制反应
• 3.2.4 反应的终止
• 3.2.5 电泳
• 3.2.6 结果检测
• 2）'>3.2.7 普通转化（CaCl₂）
• 3.2.8 克隆测序
• 3.3 实验结果及讨论
• 3.3.1 联萘酚氨基糖化合物对triplet repeat体外复制的促进作用
• 3.3.2 吩噻嗪氨基糖化合物对triplet repeat体外复制的促进作用
• 3.3.3 偶氮苯氨基糖化合物对triplet repeat体外复制的调控作用
• 3.3.4 Triplet repeat体外复制的性质研究
• 3.3.5 不同的小分子化合物对Triplet repeat体外复制的促进作用
• 3.3.6 讨论
• 3.4 结论
• 第四章 总结
• 参考文献
• 第二部分 高效DNA酶的筛选
• 第一章 引言
• 1.1 Deoxyribozyme简介
• 1.2 Deoxyribozyme的分类
• 1.2.1 具有RNA切割活性的DNA酶
• 1.2.2 具有DNA切割活性的DNA酶
• 1.2.3 具有金属化和氧化活性的DNA酶
• 1.2.4 具有自身修饰活性的DNA酶
• 1.3 Deoxyribozyme的应用
• 1.3.1 具有RNA切割活性的DNA酶在体外作为RNA限制性酶
• 1.3.2 具有RNA切割活性的DNA酶在体内切割mRNA
• 1.3.3 具有RNA切割活性的DNA酶作为传感器的应用
• 1.3.4 具有RNA切割活性的DNA酶的其它应用
• 1.3.5 具有RNA切割活性的DNA酶的药物应用
• 1.3.6 具有非天然碱基的RNA切割DNA酶
• 1.3.7 存在的问题与展望
• 第二章 高效DNAzyme的筛选
• 2.1 实验试剂及仪器
• 2.1.1 溶液及其配置
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 生物酶类
• 3.1.4 DNA序列
• 3.1.5 其他
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 寡合苷酸库的磷酸化
• 2.2.2 寡合苷酸库与底物和模板退火连接
• 2.2.3 单链寡合苷酸库和底物的分离
• 2.2.4 DNA酶的筛选反应
• 2.2.5 DNA酶与未反应的DNA的分离
• 2.2.6 PCR1,PCR2
• 2.2.7 寡核苷酸库的获得
• 2.2.8 TBAF的处理2'-OH保护基
• 2.2.9 Neutravidin固相载体进行酶筛选反应
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 筛选过程
• 2.3.2 DNA酶的结构和酶学性质
• 2.3.3 讨论
• 第三章 结论
• 参考文献
• 总结论
• 致谢
• 附录
• 附录1:联萘酚氨基糖的原始荧光数据
• 附录2:质粒pUC19的多克隆位点
• 附录3:ATT重复的重复单克隆的测序结果
• 附录4:测序得到的DNA酶的阳性克隆
• 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果
• 个人简历
• 在学期间发表的学术论文与研究成果