陈向阳１王民２１．西安交通大学医学部陕西西安７１００６８;２．西安交通大学第一附属医院骨科陕西西安７１００６８
【摘要】目的探讨同种异体骨骨移植的特性及移植物的处理.方法分离成年大鼠股骨,小心去除骨膜和骨髓,制成bFGF复合异体移植骨,HE染色观察移植骨在埋植不同时间时的组织学特征,结合HE和Masson染色,统计移植骨内部血管生成情况,分析bFGF复合异体骨移植后对血管生成的影响;分析普通骨和bFGF复合异体骨的区别;透射电镜观察bFGF复合异体骨细胞超微结构,结论成功制备bFGF复合异体骨,证实制作的骨移植材料的临床应用价值.【关键词】同种异体骨移植;成骨细胞;移植物;处理【中图分类号】R４５４【文献标识码】B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０７５７－０２
骨缺损是由严重创伤骨髓感染和骨种瘤等原因导致的,同种异体骨作为天然替代物长期用于骨骼损伤的修复,它们允许骨骼结构重建,且其表面可为骨的形成提供支持,成为自体骨移植极具有吸引力的替代品.本研究分析同种异体骨骨移植的特性及bFGF复合移植骨处理实验情况,报道如下.
１研究方法:１．１分离成年大鼠股骨,小心去除骨膜和骨髓,经脱脂液(甲醇:氯仿＝１:１)脱脂处理后,用８５℃的NaOH溶液除去骨内残余软组织和细胞,再经０．６mol/LHCl溶液脱钙,并进一步去除残余的组织和细胞,将骨组织置于EO灭菌器中灭菌,－８０℃保存１０d以上备用;１．２骨移植前２h取出－８０℃保存的骨材料,３７℃水浴５min快速升温,与１００ng/mlbFGF溶液３７℃孵育２h,制成bFGF复合异体移植骨,对照组异体骨处理时用生理盐水取代,HE染色观察bFGF复合异体骨组织学特征;
１．３选择成年雄性SD大鼠３０只,将bFGF复合异体骨置入脊柱两侧肌肉内(１５只),对照组为普通异体骨(１５只),观察术后伤口愈合情况,有无感染和炎性分泌物;１．４分别于术后４、８和１２w取出种植的骨组织,HE染色观察移植骨在埋植不同时间时的组织学特征,分析普通骨和bFGF复合异体骨的区别;１．５种植后的骨组织经Masson染色观察移植骨周围及内部胶原纤维分布情况,分析bFGF复合异体骨移植后对胶原纤维生成的影响;１．６结合HE和Masson染色,统计移植骨内部血管生成情况,分析bFGF复合异体骨移植后对血管生成的影响;１．７透射电镜观察bFGF复合异体骨细胞超微结构.
２实验结果:２．１取大鼠双侧股骨的长骨,截取１cm长骨段,分离股骨段呈乳白色;bFGF复合异体骨经HE染色后,整个基质呈粉红色,可见骨陷窝内空虚,哈佛氏管及周围陷窝中未见细胞及其他细胞成分;２．２骨移植手术后大鼠进食起居均正常,伤口愈合良好,周围软组织无红肿和炎性分泌物排出;术后４w时移植骨呈粉红色,可见移植骨周围附着纤维组织,术后８w,移植骨周围纤维组织增多,移植骨的体积减小,术后１２w,纤维组织体积继续变大,移植物不易分离,移植骨被完全吸收或小部分剩余;２．３HE染色结果显示:术后４w移植骨周围纤维细胞增生活跃,胞体较肥大,骨组织表面附着大量纤维组织,细胞成分、血管较多,移植表面与组织接触部位可见多核巨细胞,骨基质被宿主细胞缓慢吸收,对照组与bFGF复合异体骨组无显著差异;术后８w移植骨周围纤维细胞继续增生活跃,骨组织表面附着大量纤维组织增多,bFGF复合异体骨组骨基质被宿主细胞吞噬吸收,形成疏松孔洞结构;术后１２w植入异体骨仍有部分保留,大部分都已被宿主吸收降解,对照组大部分仍是纤维组织,bFGF复合异体骨组周围形成的纤维组织较多,血管分布密集,但新骨生成不明显.２．４Maaaon染色结果显示:术后４w,移植骨和宿主组织交界处附着有大量的肌纤维,局部骨组织细胞活动较强,在移植骨和宿主组织交界处,有大量吞噬细胞和血管生成,与对照组相比bFGF复合异体骨周围募集大量的血管和胶原纤维;术后８w,移植骨大部分被宿主细胞吞噬,剩余的仍可见骨组织红色的骨小梁,在与宿主交界面可见大量的吞噬细胞,骨组织周围胶原纤维和血管增多;术后１２w,移植骨附着大量有规律排列的肌纤维,移植骨内部也有胶原纤维生成,bFGF复合异体骨周围可见大量新生血管腔.２．５Masson染色结果显示术后４w、８w和１２w时移植骨组织内部血管腔内有大量橙红色血细胞;对移植骨组织内部血管密度统计发现,对照组和bFGF复合异体骨组在术后４w分别为:２２．９１±２．５９,５３．４６±５．５２,P＜０．０５;术后８w分别为:３８．１８±４．４４,６３．１７±６．０６,P＜０．０５;术后１２w分别为:６１．１１±７．８３,９９．３１±１０．８７,P＜０．０５.２．６透射电镜观察结果显示:正常骨组织细胞位于骨陷窝内,胞膜完整,胞核清晰多呈卵圆形,胞浆内细胞器和骨细胞陷窝小管清晰;与正常骨组织相比,bFGF复合异体骨骨细胞多坏死,细胞结构消失,空骨陷窝较多;骨基质缺损处可见到巨噬细胞及其它粒细胞,巨噬细胞呈肿胀状态细胞结构不完整,其延伸的突起伸向骨基质内部;骨组织周围可见到骨骼肌纤维、毛细血管和大量的红细胞,偶见肿胀的成骨细胞.
３研究结论:３．１成功制备bFGF复合异体骨,制备的骨组织有少量的无供体组织和细胞残留,骨基质保存良好,可以用于同种异体骨移植研究;
３．２骨移植术后伤口恢复良好,无伤口感染和炎性分泌物,移植骨与宿主组织相互作用,骨素质被宿主吸收现象明显,bFGF复合异体骨组在诱导胶原纤维和血管生成速度上显著高于普通异体骨;３．３bFGF复合移植骨与宿主组织相互作用,移植骨被吸收主要以巨噬细胞吞噬为主,偶见骨陷窝内有细胞生长,细胞超微结构清晰,证实我们制作的骨移植材料有一定的临床应用价值.结论本研究制作的bFGF复合移植骨的生物相容性和生物可降解性较好,有一定的开发应用价值.近年来有学者提出脱细胞骨基质,脱细胞骨基质既可脱去宿主细胞,又保留了促进成新骨生长的有机物质.后期实验计划比较骨移植材料与脱细胞骨基质在动物体内的生长特点,及对骨缺损的治疗效果,进一步探讨骨移植材料的应用价值.自体骨及亲属骨是传统的骨移植材料,它不仅提供了三维的支架,还有能形成新骨骼的成骨细胞,保留了其他移植替代物无可比拟的条件.但是,自体骨移植存在缺点,延长手术时间、二次伤害、增加感染率以及后续的血肿和骨断裂使其应用受到限制[１－２],而需求增多使得供应更加困难[３].自体移植的高病发率使其他来源的移植材料的需求更加迫切.同种异体骨作为天然替代物长期用于骨骼损伤的修复,如肿瘤切除引起的细微缺损和大段的骨丢失.由于它们允许骨骼结构重建,且其表面可为骨的形成提供支持,成为自体骨移植极具有吸引力的替代品.同种异体骨取材广泛,可减少手术的难度及受骨者的痛苦,弥补了自体骨及亲属骨移植的不足.目前日益增加的老年人群关节成型术和脊柱微创手术的新趋势,使得骨移植的材料和替代品的需求快速增加.近几年同种异体骨移植的数量急剧上升,是欧洲应用最多的骨替代品,在美国每年８００,０００同种异体骨移植的应用也反映了这一趋势.随着同种异体骨移植保存技术的发展和国内外众多骨库的建立,同种异体骨的临床应用日益增多,并取得了较成熟的经验.参考文献[１]AhlmannE,PatzakisM,RoidisN,etal．Comparisonofanteriorandposterioriliaccrestbonegraftsintermsofharvest－sitemorbidityandfunctionaloutcomes[J]．JBoneJointSurgAm,２００２,８４－A(５):７１６[－７２０．２]StevensKJ,BanulsM．Sciaticnervepalsycausedbyhaematomafrom[iliacbonegraftdonorsite[J]．EurSpineJ,１９９４,３(５):２９１－２９３．３]AbbasG,BaliSL,AbbasN,etal．Demandandsupplyofboneallografta(ndtheroleoforthopaedicsurgeons[J]．ActaOrthopBelg,２００７,７３４):５０７－５１１．