论文摘要
研究背景艰难梭菌是一种革兰阳性、产毒素或非产毒素的厌氧芽胞杆菌。目前已被公认为引起抗菌药物相关性腹泻（antibiotic associated diarrhea,AAD）和假膜性肠炎（Pseudo-membrane colitis,PMC）的重要致病菌。特别是艰难梭菌感染（clostridium difficile infection,CDI）所致医院内感染性腹泻引起国内外广泛关注与重视,其发病率和所致老年住院患者死亡率呈逐年上升趋势。CDI具有无症状携带状态、单纯性抗生素相关性腹泻、肠炎（无假膜形成）、PMC以及重症性肠炎等多种临床表现,且其致病菌具有产毒株和非产毒株之区分。实验室开展以快速、准确诊断CDI为目的的诊断技术研究尤为重要。研究目的本研究旨在建立适合临床微生物实验室的艰难梭菌标准表型培养法,探索艰难梭菌菌种鉴定和毒素快速检测的分子生物学技术,为快速、准确诊断艰难梭菌感染提供必要的实验室手段和依据。材料与方法本研究对象为68株菌株,其中21株为标准菌株（含1株为艰难梭菌ATCC9689）,为肠道定杆菌或致病菌；47株临床分离艰难梭菌菌株分离自2010年6月至11月收集的中日友好医院552例临床腹泻粪便标本。采用标准表型培养法分离腹泻粪便中的艰难梭菌,该方法包括：含10%脱纤维羊血环丝氨酸-头孢甲氧霉素-果糖培养基（cycloserine-cefoxitin-fructose agar, CCFA）上特殊菌落形态和气味、254nm紫外光下具有黄绿色荧光、革兰染色、谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）检测、L-脯氨酸氨基肽酶（L-proline aminopeptidase,PRO）试验。采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked iminunosorbent assay,ELISA）分析艰难梭菌分离株的毒素特征。用于多重PCR中的3对引物分别为艰难梭菌的种特异性的磷酸丙糖异构酶（triose phosphate isomerase-tpi）基因、毒素A基因部分序列、毒素B基因部分序列。艰难梭菌ATCC9689等21株标准菌株和47株临床分离艰难梭菌分别被应用于多重PCR最低检出限、特异性评估试验和验证试验。采用SPSS11.5统计软件进行数据处理和统计学分析。结果1.建立了可准确鉴定临床艰难梭菌分离株的标准表型培养法。2.艰难梭菌菌种使用含20%甘油脑心浸液（brain-heart infusion, BHI）培养基,-80℃可保存2年。3.552例腹泻患者粪便标本采用标准表型培养法共分离到47株艰难梭菌,对47株艰难梭菌临床分离株产毒培养后获得的上清液进行艰难梭菌毒素A/BELISA检测,20株为阳性,27株为阴性。4.建立了一种以检测艰难梭菌tpi、tcdB和tcdA为目的的多重PCR方法,对艰难梭菌ATCC9689核酸扩增后,电泳所得特异性条带均符合预期目的片段长度：tpi（227bp）、tcdB（144bp）、tcdA（112bp）、扩增产物的测序结果与靶序列完全相符。5.对艰难梭菌ATCC9689不同浓度核酸分析,tpi、tcdB、tcdA产物均阳性的最低检测限为5×10-ng/μ1,相当于2×102CFU/反应体系。对21株标准菌株核酸进行特异性分析,tpi、tcdA、tcdB产物均阳性者为艰难梭菌ATCC9689,其他菌株均为阴性,表明该多重PCR特异性为100%。6.对47株临床分离艰难梭菌分析,多重PCR方法与标准表型培养法的菌种鉴定结果完全一致；37株为tcdA（+）/B（+）,10株为tcdA（一）/B（-）,检测未检出tcdA（一）/B（+）。7.多重PCR与ELISA方法对47株艰难梭菌毒素检测结果表明,两种方法检测结果的差异有统计学意义,多重PCR方法检测毒素阳性率较高。结论本研究成功建立了一种适合临床微生物实验室的标准表型培养法和一种针对艰难梭菌疑似菌种,进行快速菌种鉴定和毒素检测多重PCR分析方法。该方法将艰难梭菌的菌种鉴定和毒素检测一步化,可减少检测步骤和缩短检测周期,对CDI诊断和治疗有着更高的应用价值。同时该方法提高艰难梭菌菌种鉴定和毒素检测的准确性,为今后实验室进一步开展艰难梭菌菌株和毒素分型、耐药分析、新克隆株发现及CDI院内感染暴发流行监测等研究创造了条件。
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