猪胰腺脂肪酶基因克隆、毕赤酵母表达及其酶活性检测

论文摘要

脂肪酶（Triacylglycerol lipase, EC 3.1.1.3）能催化甘油三酯键的断裂,是一种广泛存在于生物体的水解酶。此外,脂肪酶还具有多种酶活性,具有多样性的催化功能,是一种优秀的生物催化剂。因此,脂肪酶广泛的应用于多种领域中。在动物体中,胰腺分泌脂肪酶用于消化食物中的脂肪。将脂肪酶作为一种饲料添加剂应用于动物饲养中具有广泛的应用前景,不仅可以弥补幼禽幼畜体内脂肪酶分泌不足,还可以消除植物性饲料原料中的脂质抗营养因子,缓解我国饲料资源的不足。目前工业用途的脂肪酶主要经微生物发酵制得,但微生物产的脂肪酶存在酶源范围大筛选工作困难,筛选出的菌株产酶水平较低,酶活性低,稳定性较差,其基因的加工、分泌和调控机制不清楚,产酶菌株在不同程度上存在着一定的致病性、毒性,对动物体存在潜在危害等缺点。本研究诣在通过基因工程等手段,将编码猪胰腺脂肪酶的cDNA克隆到微生物体内,诱导表达出动物源的脂肪酶,克服了微生物源脂肪酶的缺点,具有潜在的饲用安全性和广阔的应用前景。以猪新鲜胰腺为实验材料,用Trizol法提取胰腺总RNA,采用RT-PCR技术扩增出编码猪胰腺脂肪酶（PPL）基因的cDNA序列,将其与表达载体pPICZaA连接,得到重组表达载体pPICZaA-PPL,经PmeⅠ酶切线性化后,采用电穿孔法将线性重组质粒整合到毕赤酵母X-33染色体上,采用荧光定量PCR的方法筛选具有高mRNA表达水平的酵母转化子,并用BMGY进行摇瓶培养,用甲醇在醇氧化酶Ⅰ（AOX1）强启动子的控制下进行BMMY诱导,实现外源重组蛋白PPL在毕赤酵母中的表达。外源重组蛋白经亲和层析柱（Ni Sepharose High Performance）纯化后,SDS-PAGE检测显示蛋白质分子量约为60 kDa,与预期目的蛋白产物大小相一致,产量为42mg/L。平板法定性检测重组蛋白酶具有活性,说明重组猪胰腺脂肪酶基因在毕赤酵母中获得了成功的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩写词表
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 脂肪酶研究概况
• 1.1.1 脂肪酶的来源与分布
• 1.1.2 脂肪酶的获取
• 1.1.3 脂肪酶的结构
• 1.1.4 脂肪酶的生物学特性
• 1.1.5 脂肪酶应用
• 1.2 胰脂肪酶研究进展
• 1.2.1 胰脂肪酶家族概述
• 1.2.2 胰脂肪酶结构和生理功能
• 1.2.3 影响胰脂肪酶的因素
• 1.2.4 胰腺脂肪酶应用前景
• 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.3.1 巴斯德毕赤酵母宿主菌
• 1.3.2 巴斯德毕赤酵母的表达载体
• 1.3.3 外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
• 1.3.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用前景
• 2 本研究立题依据、研究目标、内容和技术路线
• 2.1 立题依据
• 2.2 研究目标
• 2.3 研究内容
• 2.4 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 相关溶液和缓冲液的配置
• 3.1.6 引物设计
• 3.2 方法
• 3.2.1 猪胰腺脂肪酶基因（PPL）的克隆
• 3.2.2 P.pastoris/pPICZαA-PPL表达载体的构建
• 3.2.3 重组表达载体pPICZαA-PPL的毕赤酵母细胞转化及鉴定
• 3.2.4 高RNA表达水平转化子的Real-Time RT-PCR筛选
• 3.2.5 重组PPL的诱导表达
• 3.2.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.7 蛋白质浓度的测定
• 3.2.8 PPL的活性检测
• 4 实验结果与分析
• 4.1 PPL基因cDNA的克隆与分析
• 4.1.1 总RNA的提取
• 4.1.2 PPL基因cDNA RT-PCR扩增
• 4.1.3 PPL基因的TA克隆
• 4.1.4 克隆重组质粒的双酶切鉴定
• 4.2 pPICZαA-PPL重组表达质粒的构建及鉴定
• 4.2.1 pPICZαA质粒的双酶切
• 4.2.2 阳性克隆的PCR检测
• 4.2.3 pPICZαA-PPL重组表达质粒的双酶切鉴定与测序
• 4.3 P.PASTORIs/PPICZαA-PPL表达菌株的转化与筛选
• 4.3.1 重组表达载体质粒的线性化
• 4.3.2 PCR检测表达转化子菌株
• 4.3.3 Real-Time RT-PCR对转化子RNA表达量的检测
• 4.4 PPL在P.PASTORIS中的表达、纯化
• 4.4.1 表达时间,表达量和菌体密度的关系
• 4.4.2 目的蛋白Ni亲和层析
• 4.4.3 纯化蛋白浓度测定
• 4.5 纯化PPL的活性检测
• 5 讨论
• 5.1 胰腺组织总RNA的提取
• 5.2 PPL基因的克隆
• 5.3 PPL基因在毕赤酵母中的表达
• 5.3.1 表达体系的选择
• 5.3.2 PPL的诱导表达
• 5.4 活性测定分析
• 6 结论与展望
• 6.1 PPL定量酶学特性分析
• 6.2 优化PPL的发酵工艺研究
• 6.3 PPL的糖基化研究
• 6.4 改造PPL的分子结构提高其活性范围
• 6.5 PPL在动物生产中的应用
• 参考文献
• 附录
• 致谢