茯苓菌产锰过氧化物酶及其应用的研究

论文摘要

锰过氧化物酶是一种最常见的降解木质素的过氧化物酶,主要存在于各种担子菌中。茯苓[Poria cocos （Schw.） Wolf]为担子菌纲多孔菌科真菌,主要以药用,它是一种兼性寄生菌,腐生则是重要的木材腐朽菌。前人很少对茯苓的木质素降解酶进行研究。本文以锰过氧化物酶为对象,选择茯苓（P. cocos）为产酶菌种,对其培养条件进行优化；然后利用盐析、层析等技术将锰过氧化物酶分离纯化；并研究了解该酶的酶学性质,同时测试了该酶对染料和造纸黑液的脱色降解能力。大多数真菌在限氮条件下产锰过氧化物酶能力较强。所以,以高碳低氮培养基为茯苓发酵产锰过氧化物酶的基础培养基。茯苓（P.cocos）的最佳产酶条件为：蔗糖浓度20g/L,蛋白胨浓度0.2g/L,其它元素浓度150ml/L （MnSO4·2H2O 0.2g, CaCl2-2H2O 0.1g,NaCl 1g,ZnSO4·7H2O 0.1g,FeSO4·7H2O 0.1g,CuSO4·5H2O 0.1g, CoCl2 0.1g, KAl（SO4）2·l2H2O 0.01g, HBO3 0.01g, Na2MoO4·2H2O 0.01g）,金属钾离子浓度0.5mmol/L,叶温80为1g/L,初始pH值为4.5,250ml三角瓶中装液量为80ml,培养温度为35℃,转速为160r/min。产酶培养基中添加0.5mmol/L浓度的不同金属离子,有利于锰过氧化物酶的形成,其中添加Mg2+, Ca2+, K2+有助于MnP的产生。添加表面活性剂吐温80对MnP的活性影响显著,与对照相比可极大的提高MnP酶活。这是因为吐温80能够活化衰老的菌丝,在培养后期促进产酶。此培养基周期为10天,最高酶活力为1249.7U/L,明显提高了产酶效率。在茯苓菌锰过氧化物酶纯化过程中,经过浓缩及35%、85%饱和度的硫酸铵分级分离沉降后,又经Q-SepharoseTM Fast Flow离子交换层析,可以得出至少有两种MnP酶存在,分别命名为MnPⅠ、MnPⅡ。纯化后回收率分别为6.21%和7.33%,测定两锰过氧化物酶的分子量分别为46.66kDa和43.61kDa；在酶学性质方面MnP最适温度为40℃,对热的稳定性在20～40℃;最适pH值为5.0,在pH4.0-5.0范围酶的稳定性最好。酶的动力学测试以2,6—二甲氧基酚为底物测得MnP的Km值为21.27umol/L,最大反应速率为0.9975umol/min。曾有报道锰过氧化物酶对偶氮类、三苯甲烷类、醌胺类等染料和造纸厂的黑液的脱色降解起到明显的作用。本实验是就针对该酶对染料酸性橙和结晶紫的脱色情况进行研究。结果表明MnP对染料结晶紫和酸性橙降解脱色的最适反应条件为：pH5.0,反应温度为40℃,H2O2的浓度为0.15mmol/L。对三苯甲烷类染料结晶紫脱色效果较好,脱色率最高为53%。从对造纸厂黑液的降解脱色试验可以看出,黑液的稀释倍数是一个非常重要的条件,MnP对造纸黑液降解脱色的最适反应条件为：黑液稀释50倍,pH3.0,反应温度为40℃。脱色率达到27.8%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 木质素生物降解理论的研究
• 1.1 木质素在自然界中的存在和组成
• 1.2 木质素生物降解菌体系
• 1.3 参与木质素降解的酶
• 1.4 木质素生物降解的研究现状
• 2 锰过氧化物酶的研究现状
• 2.1 锰过氧化物酶的理化性质
• 2.2 锰过氧化物酶的活力测定
• 2.3 酶活单位定义
• 2.4 锰过氧化物酶发酵条件的研究
• 2.5 锰过氧化物酶的结构及功能
• 2.6 锰过氧化物酶催化反应性能
• 3 锰过氧化物酶的应用前景
• 3.1 环境保护
• 3.2 造纸工业
• 3.3 食品工业
• 3.4 饲料工业
• 3.5 染料工业
• 4 本论文的立题依据、主要内容及意义
• 第二章. 茯苓菌产锰过氧化物酶条件的优化
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种
• 2.2 主要仪器
• 2.3 培养基
• 2.4 试剂
• 2.5 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 茯苓菌在HCLN培养基中产锰过氧化物酶的曲线
• 3.2 不同碳源对茯苓菌产锰过氧化物酶的影响
• 3.3 不同氮源对茯苓菌产锰过氧化物酶的影响
• 3.4 不同pH值对茯苓菌产锰过氧化物酶的影响
• 3.5 不同装液量对茯苓菌产锰过氧化物酶的影响
• 3.6 不同温度对茯苓菌产锰过氧化物酶的影响
• 3.7 添加不同金属离子对茯苓菌产锰过氧化物酶的影响
• 3.8 添加不同的浓度表面活性剂吐温80对茯苓菌产锰过氧化物酶的影响
• 4 结论
• 第三章 锰过氧化物酶（MNP）的分离纯化及酶性质的研究
• 1 锰过氧化物酶（MNP）的分离纯化
• 1.1 引言
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 试剂
• 1.4 实验方法
• 1.5 实验结果
• 2 MNP的部分性质研究
• 2.1 实验方法
• 2.2 实验结果
• 3 结论
• 第四章 锰过氧化物酶对染料及造纸黑液脱色的研究
• 1 锰过氧化物酶对染料脱色的研究
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 结论
• 2. 锰过氧化物酶对造纸黑液脱色的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 结论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢