辛伐他汀对大鼠脑创伤后内皮祖细胞动员和损伤脑组织血管再生影响的实验研究

论文摘要

目的1．研究大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定。2．观察辛伐他汀对脑创伤后大鼠外周血内皮祖细胞动员和骨髓来源的内皮祖细胞功能的影响。3．探讨辛伐他汀对大鼠实验性脑创伤后血管再生的和空间学习能力的影响。方法1．应用密度梯度离心法分离大鼠骨髓来源的单个核细胞，应用EGM-2培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养4天换液去除未贴壁细胞，以后每3天换液一次，贴壁生长的细胞继续培养至14天。培养7天后，应用免疫荧光和流式细胞仪进行细胞鉴定。2．雄性Wistar大鼠24只，随机分为生理盐水组和辛伐他汀治疗组，每组12只，大鼠制作液压脑创伤模型成功后，伤后1天辛伐他汀治疗组应用20mg/kg/day辛伐他汀灌胃，盐水组应用等量盐水灌胃，直至伤后2周。分别于伤前、伤后3、7和14d，取外周血测CD34+/CD133+内皮祖细胞数。体外实验方面，大鼠制作液压脑创伤模型24h后，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞，将其接种于纤维连接蛋白包被的培养板，培养7天后，免疫荧光检测DiI-acLDL和FITC-UEA-1双阳细胞为正在分化的内皮祖细胞。以不同浓度辛伐他汀作用于内皮祖细胞，分别采用MTT比色法、Transwell小室和粘附能力测定实验观察内皮祖细胞的增殖、迁移和粘附能力。3．70只大鼠随机分为假手术组，盐水组和辛伐他汀组。假手术组10只，盐水组和辛伐他汀组分别为30只，制作脑创伤模型24小时后，辛伐他汀治疗组应用20mg/kg/day辛伐他汀灌胃，盐水组应用等量盐水灌胃。创伤后4、7天14天盐水组和辛伐他汀组分别随机取5只大鼠，取脑行冰冻切片免疫荧光检测CD34和免疫组化检测CD31。创伤后21到25天，假手术组，盐水组和辛伐他汀组大鼠进行Morris水迷宫检测空间学习能力，并于水迷宫检测完毕后取脑行冰冻切片免疫荧光检测CD34阳性细胞，并应用免疫组化检测CD31阳性细胞作为微血管密度（MVD）。结果1．培养4天换液去除未贴壁细胞后，细胞形态多为短梭型或多角形；培养7天，梭型细胞较前增多，形成细胞团；培养9天，可见集落形成；10天可见到细胞形成索状或网状血管样结构；14天时，细胞呈鹅卵石样外观。DiI-acLDL和FITC-UEA-1免疫荧光染色双阳细胞为正在分化的EPCs，培养细胞7天时双染阳性比例＞90％，10天时双染阳性比例＞80％。流式细胞仪鉴定培养7天时内皮祖细胞细胞表型CD34和CD133双阳性的细胞为34．27±3．20％。2．辛伐他汀显著增加大鼠脑创伤后血循环中内皮祖细胞数量，体外实验显示辛伐他汀显著改善大鼠骨髓来源的内皮祖细胞的增殖、迁移和粘附能力。3．与假手术组相比较，脑创伤后盐水组创伤区周围及伤侧海马齿状回（DG）各时间点CD34+和MVD均高于假手术组：伤后创伤区周围及伤侧海马DG各时间点CD34+数和MVD于伤后7天达到峰值，随后有所下降；应用辛伐他汀后，伤后14天和25天创伤区周围及伤侧海马DG区CD34+数和MVD明显高于与盐水组（P＜0．05）。水迷宫检测发现损伤大鼠存在明显的空间学习能力的障碍，但辛伐他汀组伤后24和25天逃避潜伏期明显比盐水组大鼠缩短（P＜0．05）。结论1．大鼠骨髓来源的单个核细胞在体外应用EGM-2培养基培养，可以分化为内皮祖细胞，为内皮祖细胞研究奠定了基础。2．辛伐他汀可以增加脑创伤后大鼠外周血内皮祖细胞动员，并增强大鼠骨髓来源的内皮祖细胞的增殖、迁移和粘附能力。3．辛伐他汀可以通过动员和促进内皮祖细胞的归巢，从而增强损伤脑组织的血管再生和促进神经功能的恢复。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、辛伐他汀对大鼠脑创伤后内皮祖细胞动员和功能的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、辛伐他汀对大鼠实验性脑创伤后血管再生和空间学习能力的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文及参加科学研究情况
• 综述
• 综述一内皮祖细胞与神经系统疾病
• 综述一参考文献
• 综述二血管再生与脑创伤
• 综述二参考文献
• 致谢