高载量重组蛋白G的原核表达、纯化及初步鉴定

论文摘要

链球菌蛋白G（Streptococcus Protein G, SPG）是在A、C和G群链球菌的细胞壁上发现的一种能够和人及多种哺乳动物的IgG以及人血清白蛋白（HSA）相结合的蛋白质,SPG同IgG的亲和力强,结合谱广,在免疫学和免疫化学上有着广泛的应用。SPG分子主要由A、B、C三个由重复的同源序列构成的功能区组成,其中A、B区负责同IgG的Fab段及HSA结合,C区负责同IgG的Fc段结合。本研究的目的是获得一种兼具有IgG的纯化和定向固定化功能的蛋白质,为制备亲和层析树脂及抗体芯片等产品提供高效的工具蛋白,据此选取编码SPG C区三个IgG Fc段结合域的基因序列,在其上游融合6×His标签和肠激酶酶切位点的编码序列,在其下游融合3个Cys的编码序列,在以上全序列的两端分别引入Bam HI和Eco RI限制性酶切位点,用人工合成的办法获得这段目的基因,连接于pUC57克隆载体并在大肠杆菌DH5α中克隆增殖,酶切鉴定并回收目的基因片段,连接于pGEX-2T表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,表达出N端带有GST和6×His双标签,C端带有3个Cys接头的高载量重组蛋白G融合蛋白。并对诱导表达时的菌体密度、IPTG浓度、诱导时间和接种量四个表达条件进行了优化。表达产物一部分以可溶蛋白形式存在,一部分以包涵体形式存在,对包涵体进行了变性、复性处理,使一部分包涵体重新折叠,转变为可溶性蛋白。借助6×His标签,用Ni2+-NTA-Sepharose亲和层析树脂对表达产物进行了纯化。用双向免疫扩散实验检测表达产物的活性,表明其与人、小鼠和兔的IgG均具有较强结合能力,初步证明本研究获得了具有生物活性的IgG结合蛋白。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写词表
• 第1章 绪论
• 1.1 链球菌蛋白G 的研究进展
• 1.1.1 链球菌及其分类
• 1.1.2 链球菌蛋白G 的发现
• 1.1.3 链球菌蛋白G 的结构与性质
• 1.1.4 链球菌蛋白G 的功能
• 1.1.5 链球菌蛋白G 的获取
• 1.1.6 链球菌蛋白G 的应用
• 1.2 大肠杆菌表达系统
• 1.2.1 原核表达载体
• 1.2.2 外源蛋白在大肠杆菌中的表达形式和部位
• 1.2.3 标签蛋白融合表达
• 1.3 本研究的立题依据及意义
• 1.3.1 本研究的立题依据
• 1.3.2 本研究的意义
• 1.4 本研究的技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及载体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 溶液及培养基的配制
• 2.2 高载量重组蛋白G 基因的设计、合成与克隆
• 2.2.1 高载量重组蛋白G 基因的设计
• 2.2.2 rhlpg 基因的合成
• 2.2.3 rhlpg 基因的克隆
• 2.2.4 碱裂解法大量提取质粒
• 2.2.5 质粒的酶切鉴定
• 2.2.6 rhlpg 基因片段的回收
• 2.3 融合蛋白GST-RHLPG 的表达
• 2.3.1 pGEX-rHLPG 表达载体的构建
• 2.3.2 pGEX-rHLPG 表达载体的克隆
• 2.3.3 融合蛋白GST-rHLPG 的表达
• 2.3.4 融合蛋白GST-rHLPG 表达条件的优化
• 2.4 融合蛋白GST-RHLPG 的纯化
• 2.4.1 菌体的破碎
• 2.4.2 包涵体的处理
• 2.4.3 融合蛋白GST-rHLPG 的分离纯化
• 2.5 融合蛋白GST-RHLPG 免疫学活性的初步鉴定
• 2.5.1 融合蛋白GST-rHLPG 与不同浓度人IgG 结合活性的检测
• 2.5.2 融合蛋白GST-rHLPG 与人、小鼠、兔IgG 结合活性的检测
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 密码子的优化
• 3.1.2 rhlpg 基因克隆载体的酶切鉴定
• 3.1.3 表达载体pGEX-rHLPG 的酶切鉴定
• 3.1.4 融合蛋白GST-rHLPG 的表达
• 3.1.5 融合蛋白GST-rHLPG 表达条件的优化
• 3.1.6 可溶性融合蛋白GST-rHLPG 的纯化
• 3.1.7 包涵体的处理
• 3.1.8 融合蛋白GST-rHLPG 免疫学活性的初步鉴定
• 3.2 讨论
• 3.2.1 基因表达的前期工作
• 3.2.2 基因表达结果及条件优化
• 3.2.3 基因表达的后期工作
• 3.2.4 进一步的研究与展望
• 第4章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT