披碱草（Elymus dahuricus）氢离子焦磷酸化酶基因EdHP1的克隆及功能鉴定

论文摘要

氢离子焦磷酸化酶（H+-PPase）是一类H+转运酶，同时它也是以焦磷酸（PPi）为底物的水解酶。H+-PPase水解PPi产生的自由能与H+跨膜转运相藕联，形成质子驱动力，与H+-ATPase一起将细胞质中的H+泵入液泡中，可以建立跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及其他溶质进出液泡提供驱动力，既能维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些无机离子（如Na+）对细胞质的毒害；同时，可以使液泡酸化和细胞质碱化，有利于细胞质中生理生化反应的顺利进行。披碱草是禾本科披碱草属多年生优质牧草，具有极强的抗旱、耐盐碱能力。本研究采用RACE方法，从披碱草中克隆了氢离子焦磷酸化酶基因EdHP1，分析了该基因的生物信息、表达模式和功能鉴定，并确定了氢离子焦磷酸化酶蛋白的亚细胞定位。（1）克隆了披碱草基因EdHP1的cDNA序列，其序列包括2310 bp的开放读码框架和356 bp 3’非转译区。生物信息学分析表明，该基因编码770个氨基酸；其蛋白含有14个跨膜区，是一个典型的膜蛋白，同时包含三个保守区（CS1、CS2和CS3）。氨基酸同源性比较发现，EdHP1与来自大麦等10种高等植物的焦磷酸化酶的同源性大于86%，与大麦焦磷酸化酶的同源性高达98％，可见H+-PPase在高等植物中是高度保守的。（2）亚细胞定位分析结果显示，EdHP1定位在质膜上。（3）EdHP1基因的表达模式分析说明，该基因的表达受干旱、高盐、低温、低磷、低钾以及重金属Cd2+等非生物胁迫的诱导。在干旱、高盐、低磷、低钾条件下，EdHP1基因的表达从1 h开始逐渐增强，在24 h达到最大；在低温胁迫下，EdHP1表达先增强后减弱，5 h表达量最高，12 h表达量开始下降；在重金属Cd2+条件下，EdHP1的表达从1 h开始逐渐增强，在12 h达到最大，24 h后有所减弱。（4）EdHP1基因的功能分析证明，在干旱、高盐、低温、低磷、低钾以及重金属Cd2+等胁迫条件下，转基因烟草生长都明显比野生型烟草好；其地上部分的生长量明显大于野生型对照；根系也明显比野生型对照发达；对烟草中H+-PPase的活性进行测定发现转基因烟草的酶活性明显比野生型对照高。在高盐和重金属Cd2+胁迫条件下，对转基因烟草和野生型对照中的Na+和Cd2+含量进行测定发现，野生型对照中Na+和Cd2+的含量明显比转基因烟草中高，可见EdHP1能将Na+和Cd2+泵到胞外。而在低磷和低钾条件下，转基因烟草中磷和钾的含量明显比对照高，可见EdHP1能促进转基因烟草对磷和钾元素的吸收。这就证明EdHP1基因不仅能够提高转基因烟草抵御干旱、高盐和重金属Cd2+离子的胁迫的能力，而且促进植物磷和钾元素的吸收。本研究首次从披碱草中克隆了EdHP1基因，通过亚细胞定位的方法证明了EdHP1是H+-PPase家族中的一个新型质膜蛋白，通过RT-PCR和Northern的方法比较全面的分析了EdHP1基因对非生物胁迫韵响应模式，比较系统的对其功能进行了鉴定，明确了质膜型EdHP1的功能。本研究不但丰富了H+-PPase家族，而且为作物抗逆遗传改良提供了新的基因资源，具有一定的理论和实践意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗逆相关基因和转录因子
• 1.1.1 渗透调节物质合成酶基因
• 1.1.2 抗氧化系统酶类基因
• 1.1.3 LEA蛋白基因
• 1.1.4 转录因子基因
• +-pyrophosphatase（H⁺-PPase）研究进展'>1.2 植物H⁺-pyrophosphatase（H⁺-PPase）研究进展
• +-PPase的属性'>1.2.1.H⁺-PPase的属性
• +-PPase的分子结构'>1.2.2 H⁺-PPase的分子结构
• +-PPase在生物体内的分布'>1.2.3 H⁺-PPase在生物体内的分布
• +-PPase酶蛋白的分子量'>1.2.4 H⁺-PPase酶蛋白的分子量
• +-PPase的主要功能'>1.2.5 H⁺-PPase的主要功能
• 1.2.6 焦磷酸酶对逆境的反应
• +-PPase在植物抵御盐及干旱胁迫中的作用'>1.2.7 H⁺-PPase在植物抵御盐及干旱胁迫中的作用
• +-PPase基因在植物中的遗传转化'>1.2.8 H⁺-PPase基因在植物中的遗传转化
• 1.3 研究的目的意义及技术路线
• 1.3.1 研究的目的意义
• 1.3.2 技术路线
• 第二章 披碱草氢离子焦磷酸化酶基因（EdHPI）的克隆与生物信息学分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 EdHPI基因3’端序列的克隆
• 2.2.2 EdHPI基因5'’端序列的克隆
• 2.2.3 EdHPI基因全长cDNA的克隆
• 2.2.4 EdHPI全长序列的生物信息学分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 材料的选择
• 2.3.2 几种植物焦磷酸酶编码氨基酸的同源性分析
• 第三章 披碱草氢离子焦磷酸化酶的亚细胞定位和表达模式分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 目标片段的扩增及载体的构建
• 3.2.2 EdHP1的亚细胞定位
• 3.2.3 EdHP1基因的表达模式分析
• 3.3 讨论
• +-PPase在细胞中的定位'>3.3.1 H⁺-PPase在细胞中的定位
• +-PPase的表达模式'>3.3.2 H⁺-PPase的表达模式
• 第四章 EdHP1基因的功能鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 转基因材料、菌株及试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 目标片段的扩增及载体的构建
• 4.2.2 转基因烟草的PCR检测
• 4.2.3 EdHPl转基因烟草的功能鉴定
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历