1.利用毕赤酵母表达牛精蛋白的研究 2.牛Myostatin活性肽编码区基因的克隆突变及其真核表达载体构建

论文摘要

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一,具有严格调控外源蛋白的表达、加工修饰表达产物、表达量高、营养要求低等优点。本实验利用PCR方法扩增得到牛精蛋白全序列,将其克隆插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的多克隆位点上,获得载体p9K-300。利用合成-扩增的方法得到去除内含子、优化的牛精蛋白基因序列,该基因用毕赤酵母菌偏好密码子替换野生型基因中毕赤酵母稀有密码子,同样将其克隆插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的多克隆位点上,获得载体p9K-160。上述两个载体与pPIC9K载体用SalI酶切线性化后,用电击转化法分别转化毕赤酵母菌株GS115。每一转化体系通过G418筛选、MM-MD平板筛选和菌落PCR鉴定后获得若干含有目的基因不同拷贝数的阳性Mut+型菌株,多数阳性菌株拷贝数高于3个。阳性菌株经诱导表达、采样,用尿素-SDS凝胶电泳分析并采取银染的方法,可见p9K-160载体阳性转化子菌株表达产物中有低分子量目的产物条带,但表达量不高,且表达量不随拷贝数增加而呈线性增长关系。p9K-300载体阳性转化子菌株表达产物中无目的产物条带。

论文目录

• 实验Ⅰ、利用毕赤酵母表达牛精蛋白的研究
• 摘要Ⅰ
• 第一章 文献综述
• 1.1 毕赤酵母表达系统
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 毕赤酵母表达系统生物学原理及组成
• 1.1.3 毕赤酵母转化、基因整合以及表达的常用方法和基本原理
• 1.1.4 影响外源蛋白表达的因素
• 1.2 精子介导转基因简述
• 1.3 精蛋白的合成、特性及应用
• 1.3.1 精蛋白的合成及其生物学功能
• 1.3.2 精蛋白的组成与进化
• 1.3.3 DNA-精蛋白结合模型
• 1.3.4 精蛋白在各学科领域中的应用
• 第二章 实验研究
• 2.1 牛精蛋白基因的毕赤酵母分泌型表达载体的构建
• 2.1.1 前言
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.4 实验结果
• 2.1.5 结果讨论
• 2.2 毕赤酵母的转化与阳性转化子的筛选
• 2.2.1 前言
• 2.2.2 实验材料
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.4 实验结果
• 2.2.5 结果讨论
• 2.3 毕赤酵母阳性转化子的诱导表达
• 2.3.1 前言
• 2.3.2 实验材料
• 2.3.3 实验方法
• 2.3.4 实验结果
• 2.3.5 结果讨论
• 2.3.6 结论
• 参考文献Ⅰ
• 实验Ⅱ、牛Myostatin活性肽编码区基因的克隆突变及其真核表达载体构建
• 摘要Ⅱ
• 第一章 文献综述
• 1.1 肌肉生成调控简述
• 1.2 动物双肌性状形成分子机理
• 1.2.1 肌肉生长抑制素的特点
• 1.2.2 牛的MSTN基因研究现状
• 1.2.3 MSTN作用机理
• 1.3 其他动物MSTN研究现状
• 1.3.1 人的肌肉生长抑制素基因
• 1.3.2 绵羊的肌肉生长抑制素基因
• 1.3.3 猪的肌肉生长抑制素基因
• 1.4 MSTN应用前景
• 第二章 实验研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果
• 2.4.1.PCR法克隆突变肌抑素活性肽基因
• 2.3.2.构建突变肌抑素活性肽基因真核表达载体
• 2.5 讨论
• 参考文献Ⅱ
• 致谢
• 附录