应用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系在sf9细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子

论文摘要

目的:应用bac-to-bac杆状病毒表达体系在sf9昆虫细胞中表达重组CDNF蛋白。方法:应用Trizol法提取小鼠组织总RNA,RT-PCR扩增得到小鼠CDNF基因全长（564bp）片段,将CDNF基因插入至转座载体pFastBacHTb中,构建重组质粒pFastBacHTb-CDNF,然后转化到E.coli DH5α感受态细胞中,以LB/Amp平板筛选阳性重组子,并经PCR、酶切及测序验证以保证重组载体的正确及可靠性;将杆状病毒转移载体pFasBacHTb-CDNF转化到DH10Bac E.coli（自带杆粒及辅助质粒）感受态细胞中,通过转座作用将目的片段整合到杆粒中,抗性及蓝白斑筛选法筛选出重组杆状病毒载体Bacmid-CDNF,使用CDNF特异引物及PUC/M13杆粒测序引物对重组杆粒进行验证;参照CELLFECTINⅡ脂质体转染剂操作说明,将重组Bacmid-CDNF杆粒转染sf9昆虫细胞,并在光学显微镜下观察细胞形态学变化,以判断转染的成功性;转染成功后,收集P1代病毒液,继续感染sf9细胞,可获取P2代和P3代病毒液,应用P3代病毒诱导重组CDNF蛋白的表达,并应用Western blot对重组蛋白的表达进行验证。结果: （1）RT-PCR结果经琼脂糖凝胶电泳显示,成功获取564bp大小的CDNF目的基因片段,重组质粒pFastBacHTb-CDNF经PCR、酶切及基因测序验证均正确无误;（2）重组转移载体pFastBacHTb-CDNF转化DH10Bac感受态细胞后,阳性bacmid-CDNF重组子经CDNF特异引物及pUC/M13杆粒测序引物PCR验证可分别获取561bp及3000bp大小目的片段,均与理论大小相符,表明杆粒构建成功;（3）重组杆粒通过Cellfectin转染剂转染sf9昆虫细胞,转染4872后,sf9细胞细胞直径逐渐增大,细胞渐脱离贴壁培养状态,随之,细胞渐渐肿胀,种种迹象均表明,杆粒转染成功,收获杆状病毒液;（4）P3代杆状病毒液感染sf9细胞,诱导重组CDNF蛋白表达,经Western blot验证,目的蛋白成功诱导表达,并符合预计大小（21KD）。结论:通过bac-to-bac杆状病毒表达系统成功诱导CDNF重组蛋白的表达。

论文目录

• 主要缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 CDNF 杆状病毒转移载体的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 结论
• 1.5 讨论
• 参考文献
• 第二部分 CNDF 重组杆状病毒表达载体的构建 及重组 CDNF 蛋白在 sf9 细胞中的表达及鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 结论
• 1.5 讨论
• 参考文献
• 第三部分 pDsRed2-C1-CDNF真核表达载体的 构建及其在大鼠MSCs原代细胞中的表达
• 1. 材料及方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 结论
• 1.5 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献