ABC转运蛋白乳腺癌耐药蛋白（BCRP）在肉鸡组织中的定位、表达及影响因素研究

论文摘要

本文主要研究了ABC转运蛋白在肉鸡组织中的表达。试验采用免疫组化、real time RT-PCR以及Western blot的方法对肉鸡的肝脏、十二指肠、空肠、回肠中BCRP的蛋白的表达进行了检测,并采取real time RT-PCR以及Western blot的定量方法探索了日龄和大肠杆菌、球虫感染及口服恩诺沙星对肉鸡不同组织中BCRP表达的影响。将肉鸡肝脏、十二指肠、回肠、空肠进行石蜡包埋后,采用免疫组织化学的方法,利用抗BCRP的抗体对以上组织中的BCRP蛋白进行组织定位。结果表明,肝脏中BCRP主要分布于肝细胞的胞浆及胞膜。在十二指肠、空肠以及回肠中,BCRP分布于肠上皮细胞以及胞核上方的胞质中。采用real time RT-PCR和Western blot方法以β-actin为内参对2周龄肉鸡肝脏、十二指肠、空肠以及回肠BCRP的mRNA和蛋白进行了检测,结果表明,mRNA的表达量在肝脏中最高,其次是空肠和回肠,十二指肠中最低,其中肝脏的BCRP mRNA的表达量极显著高于十二指肠和回肠（P=0.000,P=0.004）,显著高于空肠（P=0.024）。回肠BCRP的mRNA表达量显著高于十二指肠（P=0.043）。空肠BCRP的mRNA表达量极显著高于十二指肠（p=0.006）。而Western blot结果经统计分析后表明,BCRP蛋白的表达量在不同组织中差异不显著（p>0.05）,但是在肝脏和空肠中BCRP蛋白的表达较回肠和十二指肠的蛋白表达量略高。该结果提示肉鸡肝脏和肠道在mRNA和蛋白水平均有BCRP的表达,且蛋白水平和mRNA水平表达一致,具有显著的相关性（r=0.603,P=0.05）。采用real time RT-PCR技术和Western blot方法对第0（1日龄）、1、2、4、6和8周龄肉鸡肝脏、十二指肠、空肠和回肠中BCRP的表达,探讨了健康肉鸡组织中BCRP的表达随着日龄变化的规律。结果表明,BCRP mRNA的表达在肝脏中从0周龄（1目龄）至第2周龄逐渐升高,2周龄时mRNA表达最高,之后稍有下降,其中第2和6周龄时BCRP的mRNA表达量极显著高于0周龄（p=0.001,P=0.01）,第4周龄时BCRP mRNA的表达量显著高于0周龄（p=0.026）。在十二指肠中从0周龄起BCRP mRNA表达量便出现下降趋势,其中第2、4、6和8周龄时的表达量极显著低于0周龄（P=0.000,P=0.002,p=0.000,P=0.000）。在空肠中,1、4和8周龄时BCRP mRNA的表达量极显著高于0周龄（P=0.000,仁0.01,P=0.000）,2周龄时mRNA表达量显著高于0周龄（p兰0.029）。在回肠中BCRP的mRNA表达量在1周龄时出现最高值,极显著高于0周龄（P=0.004）,之后出现降低趋势。Western blot的结果显示,随着年龄的变化,BCRP蛋白的表达量虽有一定波动,但经统计学处理均无显著性变化（P>0.05）。将mRNA和蛋白表达进行相关性分析后,表明在各组织中BCRP的mRNA和蛋白表达并无显著相关性（r=-0.10,P>0.05）。该结果提示肉鸡在早期生长阶段BCRP mRNA表达量较高,随日龄增加会逐渐下降,但蛋白水平随日龄增加无显著变化。采用real time RT-PCR和Western blot的方法,对大肠杆菌感染肉鸡、球虫感染肉鸡以及口服恩诺沙星肉鸡的肝脏、十二指肠、空肠和回肠中BCRP的表达进行相对定量。结果表明肉鸡感染大肠杆菌后,回肠BCRP mRNA表达极显著上调（P=0.009）,而肝脏、十二指肠及空肠的BCRP mRNA表达无显著变化。Western blot结果表明,肉鸡经大肠杆菌感染后,十二指肠中BCRP蛋白表达量显著上调（p=0.043）,但在其他组织无显著变化。经大肠杆菌感染后肉鸡各组织BCRPmRNA的表达和蛋白的表达进行相关性分析,结果表明,mRNA和蛋白的表达无显著相关性（r=0.194,p>0.05）。健康肉鸡口服恩诺沙星后,十二指肠的BCRP的mRNA表达显著上调（P=0.009）,其他则无显著性变化。健康肉鸡口服恩诺沙星后,各组织中BCRP蛋白的表达量除在空肠有上升趋势外,其他组织中BCRP的表达基本没有变化。将口服恩诺沙星后肉鸡各组织BCRP mRNA的表达和蛋白的表达进行相关性分析,结果表明,mRNA和蛋白的表达无显著相关性（r==0.177,P＞0.05）。肉鸡感染球虫后,BCRP mRNA表达量在肝脏（P=0.021）、回肠（p=0.021）和空肠俨0.021)均出现显著性下调,而在十二指肠中有轻微上调,但变化不显著。BCRP蛋白的表达量在球虫感染后出现了一定变化,球虫感染使肝脏、回肠、空肠中BCRP的蛋白表达有下降趋势,与mRNA表达变化的趋势一致,呈现极显著的相关性（r=0.85,p=0.002）。该结果提示大肠杆菌感染、球虫感染和口服恩诺沙星均可在mRNA水平影响组织中BCRP的表达,但对蛋白表达无显著影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文部分縮写的中英文对照
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白家族简介
• 2 BCRP的结构
• 3 BCRP在组织中的分布及细胞定位
• 4 BCRP的底物
• 5 BCRP对药物体内过程的影响
• 5.1 药物吸收方面
• 5.2 药物分布和代谢方面
• 5.3 与药物排泄的关系
• 6 影响BCRP表达和功能的因素
• 6.1 疾病对BCRP表达和功能的影响
• 6.2 年龄对BCRP表达和功能的影响
• 6.3 性别和激素对BCRP表达和功能的影响
• 6.4 饮食中某些物质对BCRP表达和功能的影响
• 6.5 药物对BCRP表达和功能的影响
• 6.6 BCRP的基因多态性对BCRP蛋白表达及功能的影响
• 7 与兽医相关的研究
• 7.1 BCRP在常见动物的定位及表达
• 7.2 BCRP在乳腺的功能与药物残留
• 7.3 BCRP对兽药的口服生物利用度及联合用药的影响
• 8 展望
• 参考文献
• 第二章 BCRP蛋白在肉鸡组织中的定位和表达
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 免疫组织化学方法对BCRP蛋白的定位
• 2.2 RNA抽提结果
• 2.3 real time PCR动力扩增曲线、产物熔解曲线
• 2.4 肉鸡各组织BCRP mRNA和蛋白的检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• Abstract
• 第三章 不同日龄肉鸡组织中BCRP表达规律的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 不同日龄肉鸡组织中BCRF mRNA的表达水平变化规律
• 2.2 日龄对肉鸡组织中BCRP蛋白表达的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• Abstract
• 第四章 疾病感染及恩诺沙星对肉鸡组织中BCRP表达的影响
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物及处理
• 1.2 方法
• 2 结果
• 131感染模型建立'>2.1 肉鸡大肠杆菌O₁₃₁感染模型建立
• 2.2 肉鸡球虫感染模型的建立
• 2.3 大肠杆菌感染及恩诺沙星对BCRP表达的影响
• 2.4 球虫感染对肉鸡组织中BCRP表达的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• Abstract
• 全文结论
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文