论文摘要
β-防御素属抗菌肽,因具有广谱抗微生物和增强免疫作用以及对病原微生物不易产生抗性等优点而成为当前生物医学的研究热点之一。为探讨β-防御素在家禽体内的表达分布情况和抗菌活性,本研究以家禽β-防御素Gal-6为研究对象,运用分子生物学技术,从安徽三黄鸡、皖西白鹅、巢湖麻鸭不同组织中克隆出Gal-6基因片段,并构建pGEM-TEasy-Gal-6克隆载体和pGEX-4T-1-Gal-6表达载体,诱导表达后纯化得融合蛋GST-Gal-6,对纯化产物的生物活性进行了初步研究。具体内容和结果如下:1.应用RNA Trizol Reagent试剂盒抽提法,从安徽三黄鸡、皖西白鹅的骨髓和巢湖麻鸭不同组织中提取总RNA。总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳后得到两条清晰的条带（28s和18s）,经分光光度计检测OD260/OD280值在1.8-2.0之间,RNA纯度符合实验要求。2.参考GenBank注册的鸡β-防御素cDNA序列（NM001001193）,设计两对引物P1/P2、P3/P4,P1/P2扩增Gal-6基因片段,P3/P4扩增编码成熟肽基因。抽提总RNA用随机引物逆转录合成cDNA第一链,运用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）,从安徽三黄鸡、皖西白鹅的骨髓和巢湖麻鸭不同组织中克隆出目的基因,对PCR产物进行纯化回收,构建pGEM-T Easy-Gal-6克隆载体。提取纯化重组的克隆质粒并测序,经GenBank的BLAST比对:克隆安徽三黄鸡Gal-6获得的249bp碱基在第246位有一碱基变异,同源性达99%;克隆皖西白鹅Gal-6所获得的249个碱基完全相同,同源性达100%;克隆巢湖麻鸭Gal-6获得247个碱基在第12bp处缺少一个T碱基,在242bp处缺少一个T碱基,同源性达99%。分析Gal-6编码框分别由20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽组成。以pGEM-T Easy-Gal-6质粒为模板,P3/P4为引物PCR扩增出126bp碱基的成熟肽基因片段。3.检测Gal-6在巢湖麻鸭小肠、肾脏、肝脏等16个不同组织的表达分布情况。结果表明,除皮肤、肾脏、法氏囊外,而其他组织均检测到Gal-6的表达。4.首次将所克隆的巢湖麻鸭、皖西白鹅Gal-6基因序列提交GenBank,获得巢湖麻鸭Gal-6注册序列号（EU366148）、皖西白鹅Gal-6注册序列号（EU606039）。5.巢湖麻鸭Gal-6成熟肽基因和pGEX-4T-1载体双酶切后连接,构建pGEX-4T-1-Gal-6表达载体。PCR鉴定的阳性转化子增菌后经IPTG诱导表达,融合蛋白经SDS-PAGE鉴定。结果表明,GST-Gal-6融合蛋白分子量约为33kD,可存在于上清和沉淀中,最佳诱导时间为4h,30℃培养时可溶性融合蛋白在上清液中的浓度高于37℃培养。融合蛋白上清液经谷胱甘肽-琼脂糖树脂柱亲和层析纯化得GST-Gal-6融合蛋白。分光光度计检测GST-Gal-6融合蛋白含量为0.2613mg/mL。单层琼脂平板扩散法检测表达产物体外生物活性,对大肠杆菌具有一定的抑菌性。以上研究表明:本研究成功的运用分子生物学技术从家禽组织中克隆Gal-6基因片段,构建Gal-6克隆载体和成熟肽基因表达载体,IPTG诱导并纯化出目的融合蛋白,并初步探讨了纯化蛋白的活性。本论文的研究为防御素抗菌肽在畜牧业上的应用与开发提供了一定的研究基础。