基于纳米粒子及核酸内切酶的DNA生物传感器及逻辑门的研究

论文摘要

DNA的一个重要特性是DNA链可以通过碱基互补配对作用形成杂合的双链双螺旋结构,而且配对具有高度的特异性。这种特异性作用是DNA可用于构建生物传感器及逻辑门的基础之一。本文基于二氧化铈纳米粒子能够增强鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光原理,构建DNA生物传感器,用于检测血清中的蛋白质凝血酶;金属离子Hg2+与Ag+分别可以结合DNA链中的两个T碱基与C碱基而形成稳定的T-Hg2+-T碱基对与C-Ag+-C碱基对,从而诱导DNA发生变构现象,构建DNA逻辑门;进一步利用核酸内切酶对特定位点的限制性内切原理,将核酸内切酶参与的循环放大与DNA逻辑门相结合,提高了DNA逻辑门的灵敏度。本论文共分为五章:第一章,概述了DNA生物传感器的组成与分类、典型几种纳米粒子的应用前景、核酸内切酶的简介及作用并简单介绍了DNA逻辑门。第二章,研究了以磁珠为基体,并利用了金纳米粒子信号放大技术和二氧化铈纳米粒子对鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的增强作用。首先合成实验所需的二氧化铈纳米粒子,其次是利用纳米金放大技术,结构上从DNA/DNA/目标复合物和二氧化铈纳米粒子增强化学发光,通过上述方法凝血酶含量的检测范围是1.0×10-11M到1.0×10-9M,检测限为6.2×10-12M。第三章,研究了以金电极为基体电极,合成羧基联吡啶钌为电致化学发光标记物,并通过Ru（bpy）2（dcbpy）-ssDNA修饰到金电极上,因金属离子Hg2+与Ag+分别可以结合DNA双链中的两个T碱基与C碱基而形成稳定的T-Hg2+-T碱基对与C-Ag+-C碱基对,即碱基T与T间,C与C间互补配对,能够诱导DNA发生变构现象,从而引起电化学发光信号的强弱变化,完成对DNA逻辑门的构建。第四章,研究了核酸内切酶参与的信号放大与三输入条件相结合的DNA逻辑门体系。作为输入条件的三段DNA片段a,b,c只有同时存在并且浓度均高于2.0×10-11 M的条件下,才会完成对三输入逻辑门的构建。此过程在DNA内切酶与聚合酶等的作用下会不断循环,得出对于输入条件DNA的浓度在1.0×10-12 M至1.0×10-10M范围内成良好的线性关系,其检测限为4.0×10-13M。结论部分,对全文内容进行了总结。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 DNA 生物传感器的研究
• 1.1.1 DNA 生物传感器的设计原理
• 1.1.2 DNA 生物传感器的分类
• 1.1.2.1 电化学DNA 传感器
• 1.1.2.2 光学DNA 传感器
• 1.2 纳米粒子简介
• 1.2.1 纳米粒子的性质
• 1.2.2 二氧化铈纳米粒子
• 1.2.3 纳米金粒子
• 1.3 核酸内切酶
• 1.3.1 限制性核酸内切酶的简介
• 1.3.2 限制性核酸内切酶的作用
• 1.3.3 酶切分析应用
• 1.4 化学发光分析（CL）
• 1.4.1 化学发光分析的基本原理
• 1.4.2 化学发光分析的常见体系
• 1.5 应用逻辑门检测金属离子
• 1.5.1 DNA 逻辑门
• 1.5.2 金属离子的检测
• 1.6 电致化学发光（ECL）
• 1.6.1 电致化学发光分析的特点
• 1.6.2 ECL 的发光物质—联吡啶钌
• 1.6.2.1 联吡啶钌配合物标记DNA
• 1.6.2.2 联吡啶钌发光的猝灭剂—二茂铁及衍生物
• 1.7 荧光分析法（FL）
• 1.8 课题立项依据及研究内容
• 第二章 基于二氧化铈纳米粒子增强化学发光检测凝血酶的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 金纳米粒子的制备
• 2.2.2.2 纳米金粒子透射电镜表征
• 2.2.2.3 二氧化铈纳米粒子的制备
• 2.2.2.4 磁珠的洗涤与适体DNA 的修饰
• 2.2.2.5 生物条形码的制备
• 2.2.2.6 适体DNA 与生物条形码的杂交与凝血酶的化学发光检测
• 2.2.2.7 血清样品的检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实验原理
• 2.3.2 二氧化铈纳米粒子增强化学发光的机理研究
• 2.3.3 二氧化铈纳米粒子与金纳米粒子的透射电镜与紫外吸收表征
• 2.3.4 反应条件对化学发光的影响
• 2.3.5 不同进样方式对化学发光强度的影响
• 2.3.6 二氧化铈纳米粒子对发光强度的影响
• 2.3.7 凝血酶检测的线性范围
• 2.3.8 纳米金粒子的放大作用
• 2.3.9 传感器的选择性
• 2.3.10 对血清的检测
• 2.4 小结
• 2+与 Ag⁺的多组分传感分析: 新型电致化学发光逻辑门的研究'>第三章 Hg²⁺与 Ag⁺的多组分传感分析: 新型电致化学发光逻辑门的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 2（dcbpy）NHS 的制备'>3.2.2.1 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS 的制备
• 2（dcbpy）-ssDNA 的制备'>3.2.2.2 Ru（bpy）₂（dcbpy）-ssDNA 的制备
• 3.2.2.3 二茂铁甲酸标记ssDNA
• 3.2.2.4 金电极的预处理
• 3.2.2.5 电致化学检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 逻辑门的实验原理
• 3.3.2 DNA 与联吡啶钌的紫外表征
• 3.3.3 金属离子浓度对实验结果的影响
• 3.3.4 金电极DNA 负载量的研究
• 3.3.5 电致化学发光（ECL）实验最佳实验条件的优化
• 3.3.6 DNA 逻辑门的重复再生性
• 3.3.7 逻辑门的选择性-其他金属离子对结果的影响
• 3.3.8 OR gate 在河水检测中的应用
• 3.4 小结
• 第四章 基于核酸内切酶的 DNA 传感分析及 DNA 逻辑门的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 实验方法
• 1与S₂ 的杂交'>4.2.2.1 发卡DNAS₁与S₂的杂交
• 4.2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 实验原理
• 4.3.2 空白实验与酶的循环放大
• 4.3.3 电极上DNA 负载量对ECL 的影响
• 4.3.4 反应条件的优化
• 4.3.5 酶存在下的循环放大
• 4.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录:攻读硕士学位期间已发表和待发表的学术论文目录