灵杆菌非特异性核酸酶的原核表达、纯化及活性分析

论文摘要

非特异性核酸酶（non-specific nuclease,NU）是灵杆菌分泌到胞外的重要蛋白之一,它可以同时降解任何形式的DNA和RNA（单链、双链、线性或环状）。正因为它的高活性和宽泛的底物选择能力,使得其对重组表达的宿主细胞具有很强的毒害作用,从而造成其重组表达困难。本研究通过胞外和胞内两种方案构建灵杆菌非特异性核酸酶的原核表达载体,优化了其表达条件,并对纯化核酸酶的催化特性进行了研究。得到以下结论:在分泌表达载体pllp-OmpA-NU和pET22b-NU的构建过程中,均因微量的胞内本底表达使菌体生长严重受抑或者死亡,而使得分泌表达载体的构建受阻。在胞内表达载体pMAL-c4X-NU的构建中,以灵杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增非特异性核酸酶基因,经测序及BLASTN同源基因搜索发现其与S.marcescens nuclease gene的同源性为97%。并经IPTG诱导在E.coli BL21内表达了78 kDa的麦芽糖结合蛋白-NU融合蛋白（maltose-binding protein-NU,MBP-NU）,其最佳诱导表达条件为37℃,0.75 mmol/L IPTG诱导1.5 h。用Amylose resin成功纯化了MBP-NU融合蛋白,并经SDS-PAGE和Bandscan软件分析其纯度为93.8%。纯化核酸酶的活性检测实验表明,MBP-NU具有同时降解DNA和RNA的活性,其最适反应条件为37℃、pH8.0、5.0 mmol/L Mg2+。纯化核酸酶的比活力为1.11×106 U/mg,目标蛋白的纯化效率高达10.875 mg/L。纯化的目标蛋白中无蛋白酶活性存在。0.5 mmol/L乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）、1 mmol/L苯-甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）、50 mmol/Lβ-巯基乙醇以及150 mmol/L KCl或NaCl对MBP-NU的活性几乎无影响,因此MBP-NU可作为蛋白质纯化过程中核酸的高效降解酶。纯化核酸酶的去核酸效果实验表明,MBP-NU水解核酸的效率与商品Benzonase的相近。并且在无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase,PPA）的重组表达与纯化实验中,采用内标法证明,当酶浓度达到20 U/mL时,在5 min内即可使作为内标的DNA模板降解至PCR无法检测到的水平。说明MBP-NU在蛋白纯化过程中可以作为核酸水解的高效用酶,具有添加酶蛋白量少的显著特征。本研究建立了灵杆菌核酸酶的高效胞内重组表达体系,其表达量远远高于已有的分泌重组表达系统,融合MBP的核酸酶具有很高的水解效率,这些结果为在蛋白纯化中利用酶法低成本地去除核酸奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 灵杆菌概述
• 1.1.1 灵杆菌脂多糖
• 1.1.2 灵杆菌素
• 1.1.3 灵杆菌几丁质酶
• 1.1.4 其它
• 1.2 核酸酶
• 1.2.1 常用的核酸酶
• 1.2.2 具有抗肿瘤作用的核酸酶
• 1.3 灵杆菌非特异性核酸酶
• 1.3.1 灵杆菌非特异性核酸酶的理化性质
• 1.3.2 灵杆菌核酸酶的表达调控
• 1.3.3 灵杆菌核酸酶的结构研究
• 1.3.4 灵杆菌核酸酶的催化机制
• 1.3.5 灵杆菌核酸酶的应用
• 1.4 选题的目的、意义及主要研究内容
• 1.4.1 选题的目的、意义
• 1.4.2 主要研究内容
• 第二章 灵杆菌非特异性核酸酶分泌表达载体的构建
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 工具酶和主要药品
• 2.1.3 主要溶液的配方
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 TSS 法大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 灵杆菌非特异性核酸酶分泌表达载体的构建
• 2.2.3 SDS-PAGE 电泳
• 2.2.4 NU 蛋白的诱导表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 灵杆菌非特异性核酸酶分泌表达载体的构建
• 2.3.2 NU 蛋白的诱导表达（T7 表达系统）
• 2.4 讨论
• 第三章 灵杆菌非特异性核酸酶胞内表达载体的构建及表达优化
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 菌种与质粒
• 3.1.2 工具酶和主要药品
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 灵杆菌核酸酶原核表达载体的构建
• 3.2.2 序列分析
• 3.2.3 MBP-NU 融合蛋白的诱导表达
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 灵杆菌核酸酶原核表达载体的构建
• 3.3.2 灵杆菌核酸酶的序列分析
• 3.3.3 MBP-NU 融合蛋白的诱导表达
• 3.4 讨论
• 第四章 灵杆菌核酸酶的纯化与活性分析
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 工具酶和主要药品
• 4.1.2 主要溶液的配方
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 融合蛋白的纯化
• 4.2.2 纯化 MBP-NU 融合蛋白的保存
• 4.2.3 MBP-NU 融合蛋白的活性检测
• 4.2.4 EDTA 和PMSF 对MBP-NU 活性的影响
• 4.2.5 温度、pH 和盐浓度对MBP-NU 活性的影响
• 2+浓度对 MBP-NU 活性的影响'>4.2.6 Mg²⁺浓度对 MBP-NU 活性的影响
• 4.2.7 β-巯基乙醇对 MBP-NU 活性的影响
• 4.2.8 纯化的 MBP-NU 中蛋白酶活性的检测
• 4.2.9 纯化的 MBP-NU 与商业化的 Benzonase 的活性比较
• 4.2.10 纯化的 MBP-NU 的去核酸效果检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 融合蛋白的纯化
• 4.3.2 MBP-NU 融合蛋白的活性检测
• 4.3.3 EDTA 和PMSF 对MBP-NU 活性的影响
• 4.3.4 温度、pH 和盐浓度对 MBP-NU 活性的影响
• 4.3.5 Mg2+浓度对 MBP-NU 活性的影响
• 4.3.6 β-巯基乙醇对 MBP-NU 活性的影响
• 4.3.7 纯化的 MBP-NU 中蛋白酶活性的检测
• 4.3.8 纯化的 MBP-NU 与商业化产品 Benzonase 的活性比较
• 4.3.9 纯化的 MBP-NU 的去核酸效果检测
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介