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表达H5亚型AIV同义HA蛋白的质粒构建及免疫保护力测定

2020-12-10阅读(718)

表达H5亚型AIV同义HA蛋白的质粒构建及免疫保护力测定

论文摘要

禽流感（Avian Influenza）是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和疾病综合症,患病禽类可表现为呼吸系统疾病、亚临床症状和无明显症状的带毒隐形感染等一系列临床症状表现。禽流感病毒可根据致病性的不同分为高致病性禽流感病毒（HPAIV）、低致病性禽流感病毒（LPAIV）与无致病性禽流感病毒（NPAIV）这三类。其中H5N1亚型HPAIV具有感染对象种类多、宿主范围广、变异性以及致死性强等特点,并且对人类具有一定的感染能力,对我国畜牧养殖业及社会公共卫生安全都造成了严重的威胁。目前疫苗免疫是防控H5N1亚型禽流感（AI）的主要手段,其中灭活苗凭借着免疫原性好、安全性高等特点被广泛的使用。但鉴于灭活苗具有干扰临床检疫及流行病学调查的不足,很有必要开展针对H5N1亚型AIV的新型疫苗的研究,其中被誉为第三代疫苗的DNA疫苗因具有可同时激发机体产生细胞免疫和体液免疫应答、疫持续期长、易于构建、成本低廉等多种优势,具有广阔的开发研究和应用前景。为研究和探讨表达AIV同义HA基因编码蛋白对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护,通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV（2009年底以前）的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因将其克隆到真核表达载体pCAGGS中构建了重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24h、48h后分别进行表达蛋白的western-blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面；Western-blot鉴定结果表明,cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应,分子量约为70ku。将重组质粒pCACons-HA5对H5亚型不同抗原群AIV的交叉免疫保护效力进行了全面评估。分别以15μg、30μg剂量的重组质粒pCACons-HA5免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后,以相同剂量和方式进行加强免疫,加强免疫后2周,分别用105EID50的不同抗原群的HPAIV, A/Goose/Guangdong/1/96（GS/GD/1/96）（clade0）A/Duck/Hubei/S1513/2010（DK/HuB/S1513/2010）（clade2.3.2.b）, A/D uck/Guangdong/S1322/2010（DK/GD/S1322/2010）（clade2.3.2.c）, A/Duck/Fujian/31/2007（DK/FJ/31/2007）（clade2.3.4a）, A/Chicken/Shandong/A-10/2011（CK/SD/A-10/2011）（clade7.2）以鼻腔途径进行致死性攻击,观察发病与死亡情况,并分别于攻毒后第3、5、7天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时用不同的H5亚型抗原检测免疫以及攻毒后血清HI抗体的动态变化。结果,在15μg剂量组中,针对不同抗原GS/GD/1/96、DK/FJ/31/2007、DK/HuB/S1513/2010、DK/GD/S1322/2010、CK/SD/A-10/2011的HI抗体水平最高值分别为4.33Log2、2.65Log2、3.23Log2、0.5Log2和4.80Log2,并可分别诱导产生100%、100%、70%、50%和60%的免疫保护力；在30μg剂量组中,针对不同抗原GS/GD/1/96、DK/FJ/31/2007、DK/HuB/S1513/2010、DK/GD/S1322/2010、CK/S D/A-10/2011的HI抗体水平最高值分别为4.80Log2、2.78Log2、4.30Log2、0.83Log2和4.70Log2,并可分别诱导产生100%、100%、100%、70%和60%的免疫保护力。以15μg pCACons-HA5电转导免疫SPF鸡,分别用GS/GD/1/96、 DK/FJ/31/2007、DK/HuB/S1513/2010、DK/GD/S1322/2010、CK/SD/A-10/2011等5种不同抗原分别测定HI抗体水平,其HI抗体平均水平最高值分别为6.1log2、5.5log2、5.3log2、2.3log2、5.4log2;并对DK/GD/S1322/2010毒株的致死性攻击的保护力提升到80%。由免疫持续期试验结果表明,在免疫后持续观察的4个月内以15μg剂量接种的SPF鸡针对GS/GD/1/96、DK/FJ/31/2007、DK/HuB/S1513/2010、 DK/GD/S1322/2010、CK/SD/A-10/2011这5种不同抗原分支型的灭活抗原的HI抗体平均值分别为2.2log2、1.33log2、1.1log2、1.21log2、3.0log2。以30μg剂量接种的SPF鸡所产生的HI抗体平均值分别为3.0log2、2.04log2、1.3log2、2.0log2、3.4log2。本研究构建的pCACons-HA5接种15μg时可对DK/FJ/31/2007（Clade2.3.4a）及GS/GD/1/96（Clade0）产生全面的保护,接种30μg时可对GS/GD/1/96（Clade0） DK/FJ/31/2007（Clade2.3.4a）及DK/HuB/S1513/2010（Clade2.3.2b）产生全面的保护,对DK/GD/S1322/2010（Clade2.3.2c）及CK/SD/A-10/2011（Clade7.2）都具有一定的保护能力。经电转导接种方式可在一定程度上提高重组质粒的免疫效力。结果显示,重组质粒pCACons-HA5对不同抗原群的禽流感病毒具有较好的免疫保护效力,有成为广谱抗H5亚型禽流感病毒的DNA疫苗的潜质,并有必要随着流行病学的监测结果进行实时更新和研究。

论文目录

  • 摘要
  • Summary
  • 缩略语表
  • 目录
  • 第一章 禽流感疫苗研究进展
  • 1.1 禽流感病毒的生物学特性
  • 1.2 禽流感病毒的血凝素（HA）的特点
  • 1.2.1 HA的概述
  • 1.2.2 HA的结构及入侵过程
  • 1.2.3 HA蛋白与禽流感病毒毒力的关系
  • 1.2.4 针对HA蛋白的免疫研究
  • 1.3 我国禽流感流行特点
  • 1.3.1 我国总体的流行形势
  • 1.3.2 我国针对禽流感的免疫情况
  • 1.3.3 禽流感的防控
  • 1.4 禽流感与人流感的关系
  • 1.4.1 人类历史上的流感大流行
  • 1.4.2 产生大流感的病毒的可能机制
  • 1.4.3 禽流感在公共卫生学上的意义
  • 1.5 禽流感疫苗的研究
  • 1.5.1 灭活全病毒疫苗
  • 1.5.2 单位疫苗
  • 1.5.3 重组活载体疫苗
  • 1.5.4 反向遗传操作疫苗
  • 1.6 DNA疫苗的研究进展
  • 1.6.1 DNA疫苗的概述
  • 1.6.2 佐剂的使用
  • 1.6.3 密码子的优化
  • 1.6.4 DNA疫苗的免疫途径
  • 第二章 表达H5型AIV同义HA蛋白的质粒构建及免疫力测定
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 病毒株、灭活抗原及H5型阳性血清
  • 2.1.2 菌株、细胞及质粒
  • 2.1.3 SPF鸡胚和SPF鸡
  • 2.1.4 体外表达试验所用一抗及二抗
  • 2.1.5 主要试剂及仪器
  • 2.1.6 表达同义H5型AIV的HA蛋白的重组质粒的构建
  • 2.1.6.1 同义H5型AIV的HA氨基酸序列及分析
  • 2.1.6.2 Cons-HA5基因及载体pCAGGS的处理
  • 2.1.6.3 Cons-HA5基因片段与载体pCAGGS的连接
  • 2.1.7 重组质粒pCACons-HA5的酶切及PCR鉴定
  • 2.1.7.1 阳性质粒pCACons-HA5的酶切鉴定
  • 2.1.7.2 阳性质粒pCACons-HA5的PCR鉴定
  • 2.1.8 重组质粒pCACons-HA5的体外表达鉴定
  • 2.1.8.1 间接免疫荧光及观察
  • 2.1.8.1.1 293T-胞的培养及瞬时转染
  • 2.1.8.1.2 间接免疫荧光的观察
  • 2.1.8.2 western-blot分析
  • 2.1.8.2.1 转染用DNA的提取与纯化
  • 2.1.8.2.2 293T-胞的培养
  • 2.1.8.2.3 质粒的瞬时转染
  • 2.1.8.2.4 细胞的裂解
  • 2.1.8.2.5 western鉴定
  • 2.1.8.2.6 western内参处理
  • 2.1.9 重组质粒pCACons-HA5的免疫效力评估
  • 50)'>2.1.9.1 病毒的鸡胚半数致死量测定(EID50)
  • 50测定'>2.1.9.2 病毒的TCID50测定
  • 2.1.9.3 0.75%红细胞悬液的制备
  • 2.1.9.4 重组质粒pCACons-HA5的大量提取及纯化
  • 2.1.9.4.1 重组质粒pCACons-HA5的转化
  • 2.1.9.4.2 阳性克隆的大量培养
  • 2.1.9.4.3 重组质粒的大量提取及纯化
  • 2.1.9.5 SPF鸡的免疫方法及程序
  • 2.1.9.6 试验用SPF鸡的分组及免疫情况
  • 2.1.9.7 病毒攻击及其分离
  • 2.1.9.8 凝抑制用8单位抗原配制
  • 2.1.9.9 HI抗体测定
  • 2.2 结果
  • 2.2.1 重组质粒pCACons-HA5的酶切鉴定
  • 2.2.1.1 EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切鉴定
  • 2.2.1.2 NcoⅠ与DraⅠ的单酶切鉴定
  • 2.2.2 重组质粒pCACons-HA5的PCR鉴定
  • 2.2.3 重组质粒pCACons-HA5体外表达的鉴定
  • 2.2.3.1 间接免疫荧光的鉴定
  • 2.2.3.2 Western-blot鉴定
  • 2.2.4 重组质粒pCACons-HA5的免疫效力评估
  • 2.2.4.1 病毒的鸡胚半数致死量测定（EID50）
  • 2.2.4.2 组织半数感染量的测定（TCID50）
  • 2.2.4.3 pCACons-HA5对H5型不同毒株攻击的保护力试验
  • 2.2.4.3.1 15μg剂量的pCACons-HA5对H5型不同毒株攻击的保护力试验
  • 2.2.4.3.2 30μg剂量的pCACons-HA5对H5型不同毒株攻击的保护力试验
  • 2.2.4.4 电转导方式对pCACons-HA5的免疫效力的影响试验
  • 2.2.4.5 15μg pCACons-HA5免疫持续期试验
  • 2.2.4.6 30μg pCACons-HA5免疫持续期试验
  • 2.3 讨论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 导师简介

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