氨基甾体类抗白血病化合物对K562白血病细胞系的作用及其机理研究

论文摘要

目的:观察氨基甾体类化合物对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的抑制增殖和诱导分化作用,并进一步探讨其作用机制。方法:采用液体培养实验,集落培养实验,MTT实验来观察氨基甾体类化合物对K562细胞系的抑制增殖能力;采用Wright染色,联苯胺染色,细胞表面CD71表面标记物的检测来观察氨基甾体类化合物对K562细胞系的诱导分化作用。采用荧光分光光度计,激光共聚焦扫描仪,原子吸收光谱仪检测K562细胞内外钙离子浓度([Ca2+])的变化。为了进一步了解氨基甾体类化合物对K562细胞的影响与细胞内外[Ca2+]以及钙通道之间的关系,我们选取阿糖胞苷,L型钙通道激动剂BayK8644,Ca2+螯合剂EGTA和有报道称能使K562细胞内[Ca2+]升高的吲哚美辛作用于K562细胞,采用MTT实验,联苯胺染色来观察它们对K562细胞的增殖和分化的影响,同时利用原子吸收光谱仪检测它们对K562细胞内总[Ca2+]的影响。结果:1氨基甾体类化合物对K562细胞增殖能力和分化能力的影响增殖方面:MTT结果显示,终浓度为10-5mol/L的8种氨基甾体类化合物作用于K562细胞第5d,除了氨基甾体G对K562细胞的抑制增殖作用不明显外,其余7种氨基甾体类化合物对K562细胞的增殖有不同程度的抑制作用,生长抑制率（GIR）分别为A（61.21±10.03）%,B（63.03±2.28）%,C（43.38±2.96）%,D（54.49±1.14）%,E（24.43±1.26）%,F（52.96±8.74）%,H（79.88±8.88）%。分化方面:联苯胺染色结果显示,终浓度为10-5mol/L的8种氨基甾体类化合物作用于K562细胞第5d,处理组各组联苯胺染色检测值较对照组均有升高,分化程度分别为对照组的1.96（A）倍,1.92（B）倍,2.28（C）倍,2.55（D）倍,2.30（E）倍,1.99（F）倍,2.17（G）倍,2.30（H）倍。以其中一种氨基甾体C（代号H51817）为代表做进一步的研究,探讨氨基甾体类化合物对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的作用机制。2氨基甾体H51817对K562细胞增殖能力和分化能力的影响增殖方面:加入不同终浓度的氨基甾体H51817(10-9～10-5mol/L)与K562细胞连续培养,当培养至第3d和第5d,10-5mol/m的氨基甾体H51817对K562细胞的生长有抑制作用,细胞计数的GIR分别为（38.36±10.54）%和（45.92±11.15）%;10-5mol/L的氨基甾体H51817作用于K562细胞第8d的集落培养结果显示,K562细胞的增殖明显受到抑制,GIR为（77.98±6.98）%。分化方面:终浓度为10-5mol/L的氨基甾体H51817作用于K562细胞第5d Wright染色,镜下观察发现细胞体积变大,核浆比例减少,有核切迹,核染色质浓集变粗,胞质增多,浅染,核周胞质出现淡染区;流式细胞仪分析显示:终浓度为10-5mol/L的氨基甾体H51817作用于K562细胞第5d,67.74%的细胞胞膜上CD71表面标记表达呈阳性。3 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞增殖能力和分化能力的影响增殖方面:EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷作用于K562细胞第5d的MTT结果表明:0.01～1 mmol/L的EGTA对K562细胞无明显的抑制增殖作用,而0.01mmol/L的BayK8644,吲哚美辛和阿糖胞苷能分别抑制其增殖（p＜0.05）,GIR分别为（14.94±0.01）%,（18.30±0.02）%,（50.10±0.12）%。分化方面:EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷作用于K562细胞第5d的联苯胺染色结果显示:经0.01～1mmol/L的EGTA处理的K562细胞分化程度较对照组无明显的差异（p＞0.05）,而0.01mmol/L的BayK8644,吲哚美辛和阿糖胞苷使K562细胞的分化程度分别达到对照组的1.98倍,2.94倍和3.29倍。4氨基甾体H51817对K562细胞内外总[Ca2+]的影响利用荧光分光光度计检测,激光共聚焦扫描仪扫描发现:经终浓度为10-5mol/L的氨基甾体H51817处理K562细胞一定时间后,细胞内游离[Ca2+]的荧光强度有所下降;利用原子吸收光谱仪检测K562细胞外不同的环境条件下氨基甾体H51817对K562细胞内外总[Ca2+]的变化发现:DMEM组细胞内总[Ca2+]显著下降,下降率为（32.01±2.36）%,但细胞外[Ca2+]无明显变化;0.9%的生理盐水组细胞内外[Ca2+]与对照组比较均无明显变化。5 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞内总[Ca2+]的影响浓度均为0.01 mmol/L的EGTA,BayK8644,吲哚美辛和阿糖胞苷处理K562细胞30 min后,利用原子吸收光谱仪检测其细胞内总[Ca2+],结果均显示与对照组比较有下降。结论:1大多数的氨基甾体类化合物能有效地抑制K562细胞的增殖,但K562细胞对不同的氨基甾体类化合物有不同的敏感性。2所有的氨基甾体类化合物能有效地诱导K562细胞系向红系分化,但不同的氨基甾体类化合物对K562细胞的分化程度不同。3在细胞外存在Ca2+的条件下,氨基甾体H51817作用于K562细胞30min后,可以使K562细胞内游离[Ca2+]和总[Ca2+]下降,这可能与其阻断了钙通道有关。4氨基甾体H51817,非甾体类消炎药吲哚美辛,嘧啶类抗代谢药阿糖胞苷均能使K562细胞内[Ca2+]下降,而且均能抑制K562细胞的增殖和诱导其分化,说明细胞内[Ca2+]的降低可能与氨基甾体H51817对K562细胞产生抑制增殖和诱导分化的作用机制有关。5 BayK8644是L型钙通道激动剂,但在本实验中BayK8644却使K562细胞内[Ca2+]降低,并对K562细胞有一定的抑制增殖和诱导分化作用,说明在K562细胞上可能存在一种不同于典型的L型通道的钙通道,而这种钙通道可能是氨基甾体H51817的作用靶点。6 Ca2+螯合剂EGTA将K562细胞外Ca2+完全络合掉后,也使K562细胞内总[Ca2+]降低,但其对K562细胞的增殖和分化均无明显影响,说明K562细胞内仅仅[Ca2+]的降低不可能促使K562细胞发生抑制增殖和诱导分化,那么氨基甾体H51817的作用可能还伴有其他机制的参与,这有待进一步的深入研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 2.1 细胞系
• 2.2 试剂与仪器
• 2.3 实验分组
• 2.4 检测指标
• 2.4.1 K562细胞系的生长状况
• 2.4.2 8种氨基甾体类化合物对K562细胞MTT值的影响
• 2.4.3 8种氨基甾体类化合物对K562细胞内血红蛋白（Hb）联苯胺染色的影响
• 2.4.4 氨基甾体H51817对K562细胞生长的影响
• 2.4.5 氨基甾体H51817对K562细胞集落生长的影响
• 2.4.6 氨基甾体H51817对K562细胞形态的影响
• 2.4.7 氨基甾体H51817对K562细胞膜CD71表面标记表达的检测
• 2+]的影响'>2.4.8 氨基甾体H51817对K562细胞内游离[Ca²⁺]的影响
• 2+]'>2.4.8.1 荧光分光光度计检测K562细胞内游离[Ca²⁺]
• 2+]'>2.4.8.2 激光共聚焦扫描仪检测K562细胞内游离[Ca²⁺]
• 2+]的影响'>2.4.9 氨基甾体H51817对K562细胞内外总[Ca²⁺]的影响
• 2.4.10 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞增殖的影响
• 2.4.11 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞分化的影响
• 2+]的影响'>2.4.12 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞内总[Ca²⁺]的影响
• 2.5 统计学处理
• 第三章 实验结果
• 3.1 K562细胞系的生长状况
• 3.2 8种氨基甾体类化合物对K562细胞MTT值的影响
• 3.3 8种氨基甾体类化合物对K562细胞内血红蛋白（Hb）联苯胺染色的影响
• 3.4 氨基甾体H51817对K562细胞生长的影响
• 3.5 氨基甾体H51817对K562细胞集落生长的影响
• 3.6 氨基甾体H51817对K562细胞形态的影响
• 3.7 氨基甾体H51817对K562细胞膜CD71表面标记表达的检测
• 2+]的影响'>3.8 氨基甾体H51817对K562细胞内游离[Ca²⁺]的影响
• 2+]的影响'>3.9 氨基甾体H51817对K562细胞内外总[Ca²⁺]的影响
• 3.10 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞增殖的影响
• 3.11 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞分化的影响
• 2+]的影响'>3.12 EGTA,BayK8644,吲哚美辛,阿糖胞苷对K562细胞内总[Ca²⁺]的影响
• 第四章 分析与讨论
• 第五章 结论
• 第六章 附图
• 第七章 综述
• 第八章 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间的主要研究成果