坏死梭杆菌保护性抗原确定与基因筛选研究

论文摘要

坏死杆菌病是由坏死梭杆菌引起的牛、羊、鹿等家养动物和野生动物常见且发病率较高的一种危害严重的传染病。坏死杆菌病的临床效果不佳,复发率高,疫苗免疫是预防和控制坏死梭杆菌病的有效措施。 本项研究建立了坏死梭杆菌FN（A）P2001小鼠感染模型,对坏死梭杆菌免疫原及保护性抗原进行了筛选研究,通过对保护性抗原的氨基酸序列测定和基因筛选研究,结合保护性抗原的生物学试验,确定溶血素是坏死梭杆菌的保护性抗原,是致病的主要物质。该项研究为坏死梭杆菌疫苗研制及免疫机理研究打下了基础。试验结果如下: 实验将鹿源坏死梭杆菌FN（A）p2001分离株以不同菌量,不同途径接种于小鼠,逐日观察小鼠感染情况,死亡小鼠进行病理学检查和细菌分离鉴定。结果表明,坏死梭杆菌FN（A）P2001分离株具有很强的感染毒力,对小鼠的最小致死量为106个/只菌量,腹腔接种是适宜的感染途径,从而建立了坏死梭杆菌分离株小鼠感染模型。 将坏死杆菌菌体裂解,分别将上清和沉淀制成抗原,免疫家兔制备抗血清,利用抗血清通过SDS-PAGE电泳及Western-blot技术对免疫组分进行筛选研究。回收杂交阳性的蛋白条带,分别免疫小鼠,利用对流免疫电泳检测血清抗体。结果,FN（A）型菌株的3条蛋白带和FN（AB）型菌株的1条蛋白带有免疫原性。 分别切取FN（A）型菌株和FN（AB）型菌株有免疫原性的蛋白带,免疫小鼠。用对流免疫电泳试验检测免疫效果。免疫4周后进行攻毒（107个菌/只）。结果FN（A）型菌的55KD抗原有免疫保护性。用55KD抗原免疫血清,分别与各菌株裂解抗原进行琼脂扩散试验,结果,FN（AB）型菌裂解抗原与免疫血清间无沉淀线,FN（A）型菌的5株菌与免疫血清间有沉淀线,且沉淀线末端完全融合。证明FN（A）型菌的5个菌株的抗原可产生交叉免疫反应,并具有相同的抗原决定簇。 将坏死梭杆菌FN（A）型菌的2菌株培养后离心,沉淀用灭菌去离子水稀释,加胰酶裂解菌体。菌体上清液用60%饱和度的硫酸铵盐析,沉淀经悬浮式透析装置透析,收集样品。将透析后的粗分离保护性抗原样品用凝胶层析柱分离纯化,经15%SDS-PAGE电泳及Western-blot选出目的蛋白带,转印到PVDF膜上,进行蛋白质N末端序列测定。结果2株FN（A）型坏死梭杆菌提取的保护性抗原,N端氨基酸序列基本相同（各测10个氨基酸,只有第一位不同）。经GenBank检索,在已报道的坏死梭杆菌蛋白质氨基酸序列中未发现与测序结果相同的序列。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 坏死梭杆菌免疫性及免疫作用的初始研究
• 1.2.2 坏死梭杆菌免疫原筛选研究
• 1.2.3 抗原间免疫干扰
• 1.2.4 疫苗研究进展
• 1.3 研究内容和方法
• 1.3.1 建立坏死梭杆菌毒力菌株FN（A）p2001小鼠感染模型
• 1.3.2 坏死梭杆菌免疫组分筛选研究
• 1.3.3 坏死梭杆菌免疫保护性抗原筛选及交叉免疫试验
• 1.3.4 坏死梭杆菌保护性抗原分离纯化及N端氨基酸序列测定
• 1.3.5 坏死梭杆菌保护性抗原基因的筛选研究
• 第二章 研究内容
• 实验一、坏死梭杆菌毒力菌株FN（A）p2001小鼠感染模型的建立
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 临床变化
• 2.2.2 病理剖检
• 2.2.3 分离培养试验
• 2.2.4 动物回归试验
• 实验二、坏死梭杆菌免疫组分筛选研究
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1.抗血清制备
• 2.2.2 免疫原组分SDS-PAGE分离
• 2.2.3 免疫原性组分筛选
• 2.2.4 免疫原性组分的回收与免疫研究
• 实验三、坏死梭杆菌保护性抗原筛选及交叉免疫研究
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 动物免疫结果
• 2.2.2 免疫保护性实验结果
• 2.2.3 交叉免疫试验结果
• 实验四 坏死梭杆菌保护性抗原分离纯化与序列测定
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 保护性抗原粗分离
• 2.2.2 悬浮式透析装置脱盐并进一步分离保护抗原
• 2.2.3 保护性抗原的纯化
• 2.2.4 保护性抗原纯化结果鉴定
• 2.2.5 保护性抗原氨基酸序列测定
• 实验五、坏死梭杆菌保护性抗原基因的筛选研究
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 FN（A）菌株DNA的提取
• 2.2.2 DNA的单引物扩增
• 2.2.3 随机引物筛选目的基因
• 2.2.4 目的基因的反向PCR筛选
• 2.2.5 目的基因的富集与筛选
• 2.2.6 DNA序列的测定和分析
• 2.2.7 目的基因的确定
• 第三章 讨论
• 3.1 坏死梭杆菌毒力菌株FN（A）p2001小鼠感染模型的建立
• 3.2 梭杆菌菌体中抗原成分筛选
• 3.3 坏死梭杆菌免疫保护性抗原筛选与交叉免疫试验
• 3.4 坏死梭杆菌保护性抗原分离纯化与N端氨基酸序列测定
• 3.5 坏死梭杆菌保护性抗原基因的筛选研究
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• CURRICULUM VITAE
• 附录
• 附录一
• 附录二
• 附录三