牛乳酪蛋白抗氧化肽的分离纯化

论文摘要

本论文采用凝乳酶对酪蛋白进行酶解,获得水解多肽。通过单因素实验,以DPPH·的清除率为指标,考察加酶量、温度、pH值、水解时间对水解肽抗氧化活性的影响。选出影响较为显著的因素,进行正交实验,获得最佳的酶解条件。利用超滤、凝胶层析、离子交换层析和反相高效液相色谱等手段对酶解产物进行分离纯化。比较不同分离产物对DPPH·的清除能力,确定分子量、极性等因素与其抗氧化活性的关系。通过单因素和正交试验得到：各因素对酶解产物抗氧化活性的影响显著性顺序为加酶量>pH值>温度>水解时间；最佳酶解条件为pH7.0、温度40℃、加酶量200U/g蛋白,水解时间1.5h。此条件下获得的酶解产物对DPPH的清除率为79.41%,超氧阴离子清除率为70.63%,羟基自由基清除率为64.59%,并研究了酶解产物浓度对DPPH·清除率的影响,在浓度为2、4、6、8、10、12mg/mL时,清除率分别为43.74%、70.32%、82.13%、85.46%、90.82%、87.14%。其中在1Omg/mL时清除率达到最大。分离纯化结果显示：经过不同截留分子量的超滤膜过滤后,得到分子量<3kDa、3～5kDa、5～10kDa和>10kDa四个范围的肽,其中分子量<3kDa的多肽对DPPH清除能力最强,达到72.34%。在Sephadex G-15为凝胶填料,去离子水为洗脱液,流速03mL/min,上样量40mg的条件下分离分子量<3kDa的多肽,得到4个分离峰,2号峰代表的分离产物具有最高的DPPH清除率,达到82.65%,利用DEAE-52离子交换层析色谱对2号峰代表的产物分离,得到3个分离峰,峰1代表的产物对DPPH·清除率最高,达到82.71%。最后用RP-HPLC进行分离,得到8个肽峰。其中5号峰代表的产物对DPPH·的清除能力最强,0.1mg/mL的浓度下,清除率为85.37%。由此可以看出,酪蛋白酶解产物的抗氧化活性与其分子量及极性具有相关性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 牛乳的营养价值及生物活性功能
• 1.2.1 牛乳的营养价值
• 1.2.2 牛乳的生物活性功能
• 1.3 乳源生物活性肽的种类及其功能
• 1.3.1 乳本身生物活性肽
• 1.3.2 乳蛋白源生物活性肽
• 1.4 制备抗氧化肽的原料及方法
• 1.4.1 制备抗氧化肽的原料
• 1.4.1.1 动物性原料
• 1.4.1.2 植物性原料
• 1.4.2 制备抗氧化肽的方法
• 1.5 乳源抗氧化活性肽研究进展
• 1.5.1 乳源抗氧化肽的分离与纯化
• 1.5.1.1 超滤
• 1.5.1.2 凝胶过滤法
• 1.5.1.3 离子交换层析法
• 1.5.1.4 反相液相色谱法
• 1.5.2 抗氧化活性的研究方法
• 1.5.2.1 脂质过氧化检测方法
• 1.5.2.2 清除自由基能力的检测方法
• 1.5.2.3 体内抗氧化实验
• 1.5.3 乳源肽的抗氧化机理及构效关系
• 1.5.3.1 酶解过程对酶解物抗氧化活性的影响
• 1.5.3.2 分子量与抗氧化活性
• 1.5.3.3 氨基酸种类、序列与抗氧化活性
• 1.5.4 乳源抗氧化肽在食品中的应用
• 1.6 研究主要内容
• 第二章 牛乳酪蛋白抗氧化肽的酶解工艺
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料和设备
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蛋白酶活力测定
• 2.3.2 酪蛋白的酶解工艺
• 2.3.3 酶解条件的正交试验
• 2.3.4 多肽浓度的测定
• 2.3.5 抗氧化活性的测定
• 2.3.5.1 DPPH·清除率的测定
• 2.3.5.2 邻苯三酚自氧化法测抗氧化性
• 2.3.5.3 邻二氮菲法测抗氧化性
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 酶活力测定
• 2.4.1.1 酪氨酸标准曲线
• 2.4.1.2 酶活力测定的结果
• 2.4.2 Folin-酚法测蛋白的标准曲线
• 2.4.3 加酶量对抗氧化活性的影响
• 2.4.4 pH值对抗氧化活性的影响
• 2.4.5 水解温度对抗氧化活性的影响
• 2.4.6 水解时间对抗氧化活性的影响
• 2.4.7 正交试验确定酶解最佳条件
• 2.4.8 最佳酶解条件下的清除率
• 2.4.9 多肽浓度对酪蛋白酶解物抗氧化性的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 酪蛋白抗氧化肽的分离纯化
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和设备
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 超滤
• 3.3.2 Sephadex G-25凝胶层析
• 3.3.3 DEAE-52离子交换层析
• 3.3.4 RP-HPLC分离纯化
• 3.3.5 RP-HPLC制备
• 3.3.6 DPPH·清除率测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 超滤液的DPPH·清除率
• 3.4.2 凝胶分离结果
• 3.4.2.1 不同凝胶的分离结果
• 3.4.2.2 不同洗脱液的分离结果
• 3.4.2.3 不同上样量的分离结果
• 3.4.2.4 不同流速的分离结果
• 3.4.3 DEAE-52离子交换层析分离结果
• 3.4.4 RP-HPLC的分离纯化
• 3.4.4.1 洗脱液的选择
• 3.4.4.2 检测波长的选择
• 3.4.4.3 洗脱条件的选择
• 3.4.5 RP-HPLC制备
• 3.4.6 分析型RP-HPLC分离色谱峰5
• 3.5 本章小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录