侧孢芽孢杆菌BL-1产抗菌物质发酵条件的研究以及抗菌物质的分离纯化

论文摘要

侧孢芽孢杆菌菌株BL-1是一株生防菌,对烟草赤星、小麦赤霉以及稻瘟病菌等多种植物病原真菌具有抑菌作用。实验证明侧孢芽孢杆菌BL-1能够产生抗菌蛋白,但由于其在普通培养液中的抗菌物质产生水平较低,筛选BL-1菌株产生抗菌物质的适宜发酵培养基配方,优化摇瓶发酵条件,提高其抗菌物质产生水平,并分离纯化出抗菌蛋白,可为明确其有效成分的氨基酸序列并对其抗菌物质进行进一步的开发奠定基础。通过单因子试验对菌株BL-1产抗菌物质的条件进行了优化,得到最优的培养条件为,培养基初始pH值8.0、培养温度30℃、装液量90ml/250ml、转速180r/min、发酵时间48h。通过单因子试验方法对多个单因子进行筛选,明确了以葡萄糖作为碳源,以牛肉膏作为氮源最有利于抗菌物质的产生。加入NaCl和MnSO4可提高抗菌物质的产量。通过均匀设计试验方法对上述4个单因子进行配方优化筛选,建立了摇瓶发酵培养基配方筛选模型: Y=20.972+2.583X1-1.278X2-3.689X3-123.453X4-0.301X12+0.150X22+0.596X32+324.968X42据此模型推测出摇瓶发酵适宜培养基配方为:葡萄糖5.27（g/L）、牛肉膏13.10（g/L）、NaCl5.60（g/L）、MnSO4 0.35（g/L）。实验证实此适宜配方的抑菌圈直径实测值为31mm与理论值29.86mm偏差小于10%。证明模型是有效的。菌株BL-1所产的抗菌物质在45℃处理30 min后,抗菌活性显著下降,表明该抗菌物质不耐高温,对胰蛋白酶、蛋白酶K以及木瓜蛋白酶敏感,活性pH值范围在6～8之间。通过硫酸铵分级盐析条件的选择,确定了利用70%饱和硫酸铵盐析,获得粗提蛋白的分离方法。采用抑菌活性检测和SDS-PAGE跟踪检测,通过CM-Sepharose FF离子交换层析,Sephadex G25和Sephadex G50凝胶过滤柱层析等方法从菌株BL-1的发酵液中纯化了抗菌蛋白,通过SDS-PAGE电泳分析,确定该蛋白质的分子量为55kDa左右。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 侧孢芽孢杆菌生物活性研究进展
• 1.1.1 侧孢芽孢杆菌的抗菌活性
• 1.1.2 侧孢芽孢杆菌的杀虫活性
• 1.1.3 侧孢芽孢杆菌的杀线虫活性
• 1.1.4 侧孢芽孢杆菌的抗肿瘤活性
• 1.1.5 侧孢芽孢杆菌降解有机污染物活性
• 1.1.6 侧孢芽孢杆菌产生的其它活性物质
• 1.2 侧孢芽孢杆菌的分子生物学方面的研究
• 1.2.1 侧孢芽孢杆菌基因多样性的研究
• 1.2.2 侧孢芽孢杆菌相关功能基因的研究
• 1.2.3 侧孢芽孢杆菌相关功能蛋白
• 1.3 侧孢短芽孢杆菌的应用现状及展望
• 1.4 微生物源抗菌肽研究概况
• 1.4.1 微生物源抗菌肽研究现状
• 1.4.2 微生物源抗菌蛋白的分离纯化技术
• 1.5 生物农药开发的发展趋势
• 1.5.1 多功能生防菌混合培养使用
• 1.5.2 基因改造现有的野生型生防细菌
• 1.5.3 深入研究微生物之间生态学关系
• 1.6 论文研究的目的及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要药品试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 指示菌的筛选
• 2.2.2 发酵参数对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 2.2.3 营养条件对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 2.2.4 菌株 BL-1 所产抗菌物质类型的初步分析
• 2.2.5 菌株 BL-1 抗菌物质的分离纯化
• 第3章 结果与分析
• 3.1 指示菌的筛选
• 3.2 发酵参数对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.2.1 发酵时间对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.2.2 发酵温度对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.2.3 pH 值对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.2.4 装液量对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.2.5 接种量对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.2.6 种子液种龄对菌株 BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.3 营养条件对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.3.1 碳源对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.3.2 氮源对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.3.3 NaCl 用量对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.3.4 微量元素对菌株BL-1 产抗菌物质的影响
• 3.3.5 均匀试验设计结果分析
• 3.4 抗菌物质类型的初步分析
• 3.4.1 抗菌物质对热的稳定性
• 3.4.2 抗菌物质对蛋白酶的稳定
• 3.4.3 菌株 BL-1 对酸碱的稳定性
• 3.4.4 薄层层析法分析抗菌物质
• 3.5 菌株 BL-1 抗菌物质的分离纯化
• 3.5.1 硫酸铵分级盐析条件的确定
• 3.5.2 离子交换法分离抗菌物质
• 3.5.3 凝胶层析法分离抗菌物质
• 3.5.4 样品纯度的检测
• 第4章 讨论
• 4.1 菌株BL-1 所产抗菌物质的抑菌谱
• 4.2 抗菌物质性质研究
• 4.3 抗菌物质的分离纯化
• 4.4 今后工作设想
• 第5章 结论
• 5.1 菌株BL--1所产抗菌物质的抑菌谱
• 5.2 发酵条件的研究
• 5.3 抗菌物质的分离纯化
• 参考文献
• 致谢