论文摘要
第一部分:东亚钳蝎毒素的分离纯化和性质鉴定应用经典色谱的方法分离纯化东亚钳蝎毒素,经过柱层析（SephadexG-25,SephadexG-50,CM Sephadex C-25）得到六个粗毒组分（BmK221～226）,再通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）最终获得两个多肽:BmK2255和BmK2256。运用ESI-MS对两个多肽的分子量进行测定,结果显示BmK2255的分子量为7223.0Da,BmK2256分子量为7036.85Da,且均为单一性多肽。Edman降解测序法结果显示BmK2255的全长序列为VRDGYIADDK NCAYF CGRNA YCDEE CIING AESGY CQQAG VYGNACWCYK LPDKV PIRVS GECQQ,与已发现的bukatoxin（BKTx）的氨基酸序列一致;BmK 2256（暂定名为BmKNJX11）的前15个氨基酸残基序列为GRDAY IADSE NCTYT,与已发现的MakatoxinⅠ和BmK9（3）-2前15个氨基酸残基完全一致。第二部分:东亚钳蝎毒素对大鼠背根神经节动作电位的作用以大鼠背根神经节DRG神经元为标本,运用全细胞膜片钳技术在电流钳记录模式下,成功记录到了动作电位（AP）后,加入了钠通道特异性阻断剂河豚毒素（TTX）,结果显示AP的发放频率和幅值被明显抑制,用外液冲洗后部分恢复。在此基础上研究了bukatoxin和BmKNJX11对AP的作用,发现20,40μg/ml bukatoxin和BmKNJX11均使单个AP的时程延长,幅值减小,80μg/ml bukatoxin和BmKNJX11使DRG神经元几乎不发放动作电位。第三部分:东亚钳蝎毒素对神经元钠通道的作用以大鼠DRG神经元为标本,研究了BmKNJX11对TTX敏感型（TTX-S）和TTX非敏感型（TTX-R）钠电流(INa)的作用。结果表明:BmKNJX11以浓度依赖和电压依赖的方式抑制TTX-S INa和TTX-R INa。40μg/ml BmKNJX11使TTX-S INa激活曲线和失活曲线均向超极化方向移动,衰减时间常数τ变大,复活时间延长,可激活通道数目减少,使TTX-R INa激活曲线向去极化方向移动,失活曲线向超级化方向移动,衰减时间常数τ变大,复活时间延长,可激活通道数目减少,这可能是导致DRG神经元兴奋性降低,动作电位发放频率和幅值减小的原因。采用Real-Time RT-PCR技术分别研究bukatoxin对PC12细胞钠通道亚型Nav1.3和Nav1.8mRNA表达的影响,发现,bukatoxin预处理30min后,PC12细胞Nav1.3 mRNA的表达增高,但随着时间的延长,Nav1.3 mRNA表达下降;而Nav1.8 mRNA的表达下降,随着时间的延长,Nav1.8 mRNA表达下降得更加明显,但7hr时Nav1.8mRNA表达有所回升。第四部分:东亚钳蝎毒素对大鼠背根神经节钾通道的作用以大鼠DRG神经元为标本,运用膜片钳技术研究了bukatoxin和BmKNJX11对电压门控钾离子通道的作用。结果表明:80μg/mlbukatoxin对全钾电流（IK）、延迟整流钾电流(IKDR)、瞬时外向钾电流（IA）无明显作用;80μg/ml BmKNJX11对IK(主要成分为IKDR和IA)有轻微的抑制作用,使IA减小至加药前的85.3±1%,IKDR减小至加药前的78.12±2%。第五部分:东亚钳蝎毒素对大鼠背根神经节GABAA受体的作用运用全细胞膜片钳技术在急性分离的大鼠DRG神经元上依次加入1～1000μmol/L GABA诱导出一内向电流,该电流随着GABA浓度增大而增大,且在-100～0 mV范围内为负向电流,在0～+40 mV范围内为正向电流,翻转电位为0 mV,表明该电流具有浓度依赖性,且在-100mV～+40mV内具有电压依赖性。在记录到稳定的IGABA后,加入GABAA受体的特异性拮抗剂荷包牡丹碱（bicuculline,Bic）,电流明显被抑制,而加入特异性激动剂四氢吡啶甲酸（isoguvacine,ISO）后,电流明显增大,证明所记录到的电流为GABA激活电流。在建立了配体门控离子通道记录方法的基础上,研究了bukatoxin和BmKNJX11对GABA激活电流的作用。结果显示bukatoxin对大鼠DRG神经元IGABA有浓度依赖性的抑制作用,半数抑制浓度(IC50)为42.26μg/ml,Hill系数（h）为2.01。BmKNJX11对IGABA有浓度依赖性的兴奋作用,半数有效浓度(EC50)为60.4μg/ml,Hill系数（h）为3.4。
论文目录
相关论文文献
标签：东亚钳蝎论文; 分离纯化论文; 膜片钳论文; 动作电位论文; 钠离子通道论文; 钾离子通道论文; 受体论文; 大鼠论文; 背根神经节论文;