论文题目: GA对大白菜开花的诱导效应及利用RNAi技术获得晚抽薹转基因大白菜
论文类型: 博士论文
论文专业: 园艺学
作者: 夏广清
导师: 何启伟,赵双宜
关键词: 大白菜,开花,基因,抑制表达载体,遗传转化
文献来源: 山东农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 植物生长发育受遗传因素和内外环境的影响。两者共同调控植物的生长发育、形态建成及开花结实等发育过程。其发育过程中不同信号传导途径间及它们之间的Cross-talking已被人们认识。赤霉素在大多植物中参与成花转变的信号传导过程,但其具体作用因植物而异,多种情况下可加速成花转变。本研究以冬性不同的两个大白菜（Brassica Campestris L,ssp pekinesis）B-17和1039自交系为试材,分别研究了植物成花生理信号（赤霉素）以及成花关键基因（LFY）的表达调控及在植物成花转变过程中的作用机理;同时采用RT-PCR方法,从大白菜花蕾中克隆了开花关键基因LFY,并构建了其双链dsRNA表达抑制载体,通过农杆菌介导法将其转入冬性较弱的秋大白菜1039中,并对转基因植株进行了形态学、生理学和分子生物学的研究,主要试验结果如下: （1）GA处理后可以使不同生态型的大白菜开花明显提前,同时使植物体内物质代谢、酶活性、DNA甲基化水平和内源GA含量发生了改变,具体表现为:随GA处理浓度增加,两个大白菜试材中可溶性总糖、蔗糖、淀粉和可溶性蛋白及内源GA含量增加:POD、α-淀粉酶活性升高而EST活性变化不明显;DNA甲基化水平降低。然而大白菜的冬性不同,对GA处理浓度反应也不同,在相同的条件下,弱冬性1039大白菜试材开花明显先于冬性较强的B-17大白菜试材,因此对冬性较弱的大白菜,较低的GA处理浓度就可以促进其开花。 （2）利用Northern杂交和相对定量PCR（RQRT-PCR）技术分析了GA不同处理浓度对大白菜种子、幼苗、花蕾中LFY基因表达的影响及其与LFYmRNA表达之间的关系。结果表明,LFY基因的mRNA在GA不同处理浓度下均有表达,并且在一定范围内,其表达量和GA处理浓度正相关。表明GA处理后,由于促进了大白菜不同发育阶段LFY基因的表达活性和其表达量,进而促进植物开花。 （3）通过改变培养基pH值和琼脂糖浓度,获得了由大白菜子叶-子叶柄诱导胚状体和不定芽的培养基配方。其分化生长培养基的配方分别为:MS培养基+3%蔗糖+4.5mg. L-1 6-BA+0.5 mg. L-1 IAA, pH 6.0-6.2,琼脂糖浓度为1.0%-1.2%及MS培养基+3%蔗糖+4.5 mg. L-1 6-BA+0.5 mg. L-1 IAA, pH5.7-5.8,琼脂糖浓度为0.8%-0.9%。通过对本实验供试的三个不同大白菜试材的比较研究发现,当pH值在6.0-6.2,琼脂糖浓度在0.8%-0.9%时,1039大白菜试材中有胚状体的形成,其诱导频率为1%左右,而当pH值
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英文摘要
Ⅰ.引言
1 植物的开花生理
1.1 高等植物开花机理研究
1.1.1 高等植物开花过程中物质等代谢的变化
1.1.2 高等植物开花过程的分子机理研究
1.2 十字花科蔬菜中开花相关基因的分离及其功能
1.3 GA在植物成花中的作用
1.4 LFY基因的特点及其在基因调控网络中的作用
1.4.1 LFY基因的时空表达
1.4.2 LFY基因在成花各阶段中的作用
1.4.3 影响LFY表达的生理因子
1.5 基因沉默研究
1.5.1 RNA沉默现象的机制及其应用
1.5.2 RNA沉默的生物学意义
1.5.3 RNA沉默的应用
1.6 本研究的立题依据
Ⅱ 研究报告
第一章 GA处理对大白菜碳水化合物含量的影响
1.1 材料和方法
1.1.1 试验材料和GA处理
1.1.2 碳水化合物含量的测定
1.2 结果与分析
1.2.1 可溶性糖的变化
1.2.2 蔗糖含量的变化
1.2.3 淀粉含量的变化
1.3 讨论
第二章 GA处理后大白菜体内蛋白质、酶和DNA甲基化水平的变化
2.1 材料与方法
2.1.1 植物材料和GA处理
2.1.1.1 可溶性蛋白含量的测定
2.1.2.2 过氧化物同工酶(POD)活性的测定
2.1.2.3 α-淀粉酶活性的测定
2.1.2.4 酯酶EST活性测定
2.1.2.5 DNA甲基化水平的测定
2.1.2.6 内源GA含量的测定
2.2 结果与分析
2.2.1 GA处理对大白菜可溶性蛋白含量的影响
2.2.2 GA处理对大白菜同工酶活性的影响
2.2.2.1 GA处理对大白菜POD活性的影响
2.2.2.2 GA处理对大白菜α-淀粉酶活性的影响
2.2.2.3 GA处理对大白菜EST活性的影响
2.2.2.4 GA处理对大白菜DNA甲基化的影响
2.2.2.5 GA处理对大白菜内源GA含量的影响
2.2.2.6 GA处理对LFY基因表达的影响
2.3 讨论
第三章 大白菜开花基因LFY的克隆、dsRNA-LFY植物表达载体的构建
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 菌种及质粒
3.1.3 试剂
3.2 方法
3.2.1 RNA的提取方法
3.2.2 LFY基因的克隆
3.2.3 双链RNA抑制载体dsRNA-LFY的构建
3.2.4 重组植物表达载体向农杆菌的转化
3.3 结果与分析
3.3.1 LFY基因的克隆及反义和正义LFY基因的PCR扩增
3.3.2 双链RNA抑制载体的构建
3.4 讨论
3.4.1 关于引发RNA沉默片断长度及内含子片段的探讨
3.4.2 使用RNA干扰技术时应注意的问题
第四章 大白菜再生体系和遗传转化体系的建立
4.1 试验材料和方法
4.1.1 无菌苗的获得
4.1.2 外植体及接种方式
4.1.3 遗传转化所用的植物材料、菌株及抗生素
4.1.4 培养基
4.1.5 双链dsRNA-LFY转化植株的获得
4.1.6 T_0代转基因植株的扩繁
4.2 实验结果与分析
4.2.1 pH和琼脂糖浓度对对大白菜子叶-子叶柄的诱导及其转化频率
4.2.2 大白菜dsRNA-LFY片段转化植株的获得
4.3 讨论
第五章 转基因植株的分子检测和生理生化指标的检测
5.1 材料和方法
5.1.1 材料
5.1.2 植物基因组DNA和总RNA的提取
5.1.3 转化植株的PCR检测
5.1.4 转化植株Southern blot检测
5.1.5 转化植株Northern blot检测
5.2 结果与分析
5.2.1 转化植株的PCR检测
5.2.2 抗性植株的Southern blot检测
5.2.3 转化植株的Northern blot检测
5.3 讨论
第六章 转基因植株的形态学及相关生理生化指标的分析
6.1 材料与方法
6.1.1 试验材料
6.1.2 试验方法
6.2 结果与分析
6.2.1 转基因植株的形态变化
6.2.2 转基因大白菜碳水化合物含量的变化
6.2.3 转基因大白菜可溶性蛋白含量及同功酶活性的变化
6.2.4 转基因植株激素水平的变化
6.3 讨论
6.3.1 转入LFY基因后，增加了大白菜开花时的叶片数
6.3.2 转入LFY基因后，改变了大白菜体内碳水化合物的含量
6.3.3 转入LFY基因后，改变了植株体内可溶性蛋白含量和同工酶的活性
6.3.4 转入LFY基因后，改变了植株体内激素的水平
7 结论
参考文献
附录
致谢
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发布时间: 2005-10-11
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