猪传染性胃肠炎病毒SC-H株重组N蛋白单克隆抗体的制备

论文摘要

猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis virus of swine,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis vires of swine,TGEV）引起的一种高度接触性肠道传染病,临床症状主要表现为发病仔猪严重腹泻、呕吐和脱水,该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。本研究以TEGV重组N蛋白为免疫抗原,成功制备了抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体,对TGE的诊断、预防和控制具有较大的意义。1、TGEV重组N蛋白的制备、纯化与鉴定将猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因重组表达质粒pET-32a-N转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后获得融合N蛋白,SDS-PAGE检测大小约67KD。大部分重组N蛋白以包涵体形式表达,采用金属离子亲和层析方法在变形条件下纯化。实验确定以20mM咪唑浓度的PBS缓冲液为杂蛋白的清洗缓冲液,以100mM咪唑浓度的PBS缓冲液为TEGV重组N蛋白的洗脱缓冲液。纯化后获得了高纯度的N蛋白,SDS-PAGE观察为单一清晰的条带,经核酸蛋白测定仪测定该蛋白浓度为1500μg/ml。免疫印迹实验证明重组N蛋白具有与猪传染性胃肠炎病毒阳性血清反应的反应原性。2、抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的制备以纯化的TGEV重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行融合,融合率达85%（融合率=有杂交瘤细胞生长的细胞培养孔数/总细胞培养孔数）。通过间接ELISA方法对融合细胞进行筛选,阳性率为65%（阳性率=阳性杂交瘤细胞孔数/有杂交瘤细胞生长的细胞培养孔数）。阳性细胞经有限稀释法进行4次亚克隆后,获得了3株能稳定分泌抗重组N蛋白抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY（4）-1、JY（4）-2、JY（4）-3。间接ELISA检测3株杂交瘤细胞的细胞培养上清和免疫小鼠制备的腹水及血清中的抗体效价均为1:512、1:105、1:105,且单抗与猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸道综合症病毒（PRRSV）、猪轮状病毒（PRV）抗原之间均无交叉反应性,间接免疫荧光证实该单抗能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,初步证实抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体具有良好的特异性,为进一步研究TGEV N蛋白及建立猪传染性胃肠炎的诊断方法提供了条件。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 前言:
• 综述一 猪传染性胃肠炎病毒研究进展
• 1.TGEV病原学特征
• 2.TGEV分子生物学特征
• 2.1 基因组结构
• 2.2 结构蛋白及其功能
• 2.3 非结构蛋白
• 3 猪传染性胃肠炎诊断技术研究进展
• 3.1 病原学诊断技术
• 3.2 血清学诊断技术
• 3.3 分子生物学检测技术
• 综述二 杂交瘤技术原理及单克隆抗体研究进展
• 1 杂交瘤技术原理
• 2 单克隆抗体研究进展
• 2.1 免疫原研究进展
• 2.2 免疫途径研究进展
• 2.3 融合方法研究进展
• 2.4 生产单克隆抗体的研究进展
• 2.5 各种新的单克隆抗体
• 3 单克隆抗体在TGEV相关研究中的应用
• 研究目的与意义
• 第二部分 试验研究
• 第一章 猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白的制备、纯化与鉴定
• 1 材料
• 1.1 菌株与毒株与实验动物
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 其它
• 2 实验方法
• 2.1 TEGV N蛋白的表达
• 2.2 TEGV N蛋白的纯化
• 2.3 纯化TGEV重组N蛋白的鉴定
• 3 结果
• 3.1 重组N蛋白的SDS-PAGE鉴定
• 3.2 重组N蛋白的纯化
• 3.3 纯化的重组N蛋白的透析复性
• 3.4 纯化重组N蛋白的免疫血清效价
• 3.5 Western-blotting检测纯化蛋白活性
• 4 讨论
• 4.1 TGEV N蛋白作为诊断抗原的依据
• 4.2 TGEV重组N蛋白亲和层析纯化方法的建立
• 4.3 TGEV重组N蛋白在复性过程中出现的包涵体重聚现象
• 4.4 纯化TGEV重组N蛋白的特异性
• 5 小结
• 第二章 TGEV重组N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料
• 1.1 细胞与病毒
• 1.2 TGEV重组N蛋白
• 1.3 实验动物
• 1.4 主要试剂及配制
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 其它
• 2 实验方法
• 2.1 检测单克隆抗体的间接ELISA方法的建立
• 2.2 免疫小鼠
• 2.3 制备饲养细胞
• 2.4 融合细胞的制备
• 2.5 TGEV重组N蛋白免疫的小鼠脾细胞与SP2/O细胞的融合
• 2.6 杂交瘤细胞培养上清中抗体的检测
• 2.7 杂交瘤细胞的亚克隆
• 2.8 杂交瘤细胞的扩大培养与冻存、复苏
• 2.9 抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的制备及效价测定
• 2.10 抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的纯化
• 2.11 抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的鉴定
• 3 结果
• 3.1 检测单克隆抗体的间接ELISA方法的建立
• 3.2 杂交瘤细胞株的建立
• 3.3 单克隆抗体的制备及效价的测定
• 3.4 单克隆抗体间接免疫荧光鉴定
• 3.5 单克隆抗体交叉反应性鉴定
• 3.6 杂交瘤细胞的稳定性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 关于杂交瘤技术
• 4.2 抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的运用前景
• 5 结论
• 第三部分 参考文献
• 致谢
• 附录