河豚毒素特异性单克隆抗体的制备

论文摘要

河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)是毒性最强的非蛋白类神经毒素之一,分布广泛,因最早从河豚鱼体内分离而得名。在众多河豚毒素的检测技术中,免疫检测技术因其灵敏度高和操作简便等优点受到人们的青睐,而免疫学检测的关键要素是目标物质的特异性抗体。本研究首先以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumi,OVA)、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体蛋白,分别与TTX进行偶联以制备人工完全抗原。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及紫外分光光度分析方法,优化了河豚毒素人工完全抗原(BSA‐TTX)的合成条件,并筛选出较佳的反应条件,即反应时间为72h、偶联剂添加量为12%、TTX与BSA质量比为1:5时河豚毒素免疫抗原偶联率较大。同时应用聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外分光光度法、红外光谱检测技术以及Quantity One凝胶分析软件计算偶联率等方法建立了人工完全抗原的表征体系。然后利用制备出的两种免疫抗原OVA‐TTX和KLH‐TTX免疫Balb/C小鼠,通过杂交瘤技术成功制备出两株杂交瘤细胞OVA 1E3和KLH CB2。两株细胞分泌的单克隆抗体均为IgM型,对两种单克隆抗体的特异性鉴定结果显示两种单抗均与TTX有特异性结合。此外,本研究还针对不同载体蛋白对单克隆抗体制备产生的影响机理进行了初步探讨。以疏水相互作用理论为基础,结合不同蛋白的疏水性能,推理认为KLH是一种较适合于TTX特异性单抗制备的载体蛋白。本课题的研究为河豚毒素的免疫学分析检测奠定了物质基础,对推动河豚毒素免疫学检测技术的发展具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 河豚毒素免疫检测技术研究进展
• 1.1 河豚毒素简介
• 1.2 河豚毒素检测技术研究进展
• 1.2.1 传统检测技术
• 1.2.2 快速检测技术
• 1.3 免疫检测技术在河豚毒素检测中的应用现状
• 1.3.1 河豚毒素免疫检测技术研究现状
• 1.3.2 河豚毒素免疫检测技术的研究现状总结
• 1.3.3 河豚毒素免疫检测技术的展望
• 第二章 河豚毒素完全抗原的制备
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 主要实验试剂
• 2.1.2 主要实验设备
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 河豚毒素包被抗原（BSA‐TTX）的制备及制备条件的优化
• 2.2.2 河豚毒素免疫抗原（OVA‐TTX、KLH‐TTX）的制备
• 2.2.3 河豚毒素完全抗原的表征
• 2.2.4 偶联率的确定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 载体蛋白（BSA）与河豚毒素偶联物的表征体系
• 2.3.2 最佳偶联时间的确定
• 2.3.3 偶联剂最佳添加量的确定
• 2.3.4 最佳TTX 与BSA 质量比的确定
• 2.3.5 载体蛋白OVA 与河豚毒素偶联物的表征体系
• 2.3.6 载体蛋白KLH 与河豚毒素偶联物的表征体系
• 2.3.7 偶联率的计算
• 2.4 小结
• 第三章 河豚毒素单克隆抗体的制备
• 第一节 河豚毒素单克隆抗体的制备与鉴定
• 3.0 材料与设备
• 3.0.1 主要实验试剂
• 3.0.2 实验动物和细胞
• 3.0.3 主要实验设备
• 3.0.4 主要溶液配制
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 河豚毒素完全抗原免疫方案
• 3.1.2 免疫小鼠血清抗体效价的检测
• 3.1.3 SP2/0 骨髓瘤细胞的培养
• 3.1.4 细胞融合方法
• 3.1.5 杂交瘤细胞的筛选
• 3.1.6 杂交瘤细胞株的克隆（有限稀释克隆法）
• 3.1.7 单克隆抗体（细胞上清液中）特异性的检测
• 3.1.8 单克隆抗体类型的鉴定
• 3.1.9 单克隆抗体的大量制备
• 3.1.10 单克隆抗体的纯化
• 3.1.11 单克隆抗体浓度的测定
• 3.1.12 河豚毒素单克隆抗体特异性抑制曲线的测定
• 3.1.13 测定单克隆抗体的交叉反应
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 免疫小鼠血清抗体效价的检测
• 3.2.2 杂交瘤细胞阳性反应率的检测
• 3.2.3 杂交瘤细胞筛选结果
• 3.2.4 单克隆抗体（细胞上清液中）特异性的检测
• 3.2.5 单克隆抗体类型的鉴定
• 3.2.6 单克隆抗体浓度的测定
• 3.2.7 TTX 对单克隆抗体的抑制性
• 3.2.8 单克隆抗体特异性的检测
• 3.3 小结
• 第二节 不同载体蛋白对单克隆抗体制备的影响
• 3.1 载体蛋白氨基酸序列的获得
• 3.2 载体蛋白氨基酸序列的分析比较
• 3.3 不同载体蛋白对单克隆抗体制备的影响
• 3.4 小结
• 结论和展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢