枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究

论文摘要

角蛋白酶（keratinase）是一种可特异降解角蛋白的蛋白酶类。近年来角蛋白酶在多个领域中具有良好的应用前景,特别是在饲料生产中,通过角蛋白酶作用将废弃羽毛降解后作为动物饲料的添加剂,充分利用废弃的羽毛蛋白资源,这将改善蛋白质饲料短缺的现状。本研究利用DNA重组技术将来自于枯草芽孢杆菌B-3的角蛋白酶基因kerC表达在巴斯德毕赤酵母X-33中,成功实现了角蛋白酶基因kerC在真核表达系统中的高效表达,并对其酶学性质进行了研究,主要研究结果如下：1.根据枯草芽孢杆菌B-3角蛋白酶基因kerC（GenBank No.:JN021789）,设计去除信号肽并含有EcoRI和XbalI酶切位点的上下游引物,PCR扩增角蛋白酶基因kerC表达片段。测序表明,扩增kerC基因表达片段中3个碱基发生错义突变,致使3个氨基酸发生改变。对编码的角蛋白酶蛋白空间结构进行分析,发生改变的3个氨基酸部位未在其活性中心。2.将重组表达载体pPICZaA-kerC线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母X-33感受态细胞,转化子经Zeocin的抗性筛选、PCR鉴定和酶活力测定,确定6株阳性转化子。重组菌株P.X.KC-9在以1%浓度的甲醇诱导培养108 h后,其酶活力最高,达到32.31U/mL,比活力为95.43 U/mg。3.测定该重组角蛋白酶的酶学性质,结果表明,重组角蛋白酶kerC的最适反应温度为60℃,在30℃-65℃范围内能保留最高酶活的97%以上。kerC的最适反应pH为pH7.5,在中性和弱碱性环境中对羽毛粉具有较强的降解能力,在pH7-8范围区间内能保持最高酶活的80%以上。在0.33 mM的离子作用浓度环境中,Fe2+、Co2+和Ca2+能增强kerC角蛋白酶的活力,其中Fe2+提高36.44%。Fe3+完全抑制重组角蛋白酶的酶活力,Na+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和Cu2+也均15.56%-77.78%范围内,不同程度上抑制了重组角蛋白酶的酶活力。经SDS-PAGE分析,重组菌株P.X.KC-9表达的角蛋白酶的分子量约为31 KDa,与预测值相近。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 角蛋白的研究进展
• 1.1.1 角蛋白的分子结构
• 1.1.2 角蛋白的资源化利用
• 1.2 角蛋白酶的研究进展
• 1.2.1 产角蛋白酶的微生物
• 1.2.2 角蛋白酶的理化性质
• 1.2.3 角蛋白酶的降解机理
• 1.2.4 角蛋白酶编码基因的克隆及其异源表达
• 1.2.5 角蛋白酶的应用前景及展望
• 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
• 1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达菌株和载体
• 1.3.3 影响外源基因在巴斯德毕氏酵母中表达的因素
• 1.4 本研究的前期工作、目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 常用缓冲液
• 2.1.4 角蛋白酶酶活力测定试剂
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 角蛋白酶基因kerC重组表达载体的构建
• 2.2.2 重组表达载体pPICZαA-kerC的电击转化
• 2.2.3 高效表达菌株的筛选
• 2.2.4 重组菌株的诱导时间和甲醇浓度的优化
• 2.2.5 重组菌株的遗传稳定性分析
• 2.2.6 P.pastoris X-33诱导表达的角蛋白酶的酶学性质分析
• 2.2.7 重组角蛋白酶的SDS-PAGE分析
• 3 结果
• 3.1 重组表达载体pPICZαA-kerC的构建
• 3.1.1 kerC基因表达片段的高保真酶扩增
• 3.1.2 T-kerC阳性转化子的筛选
• 3.1.3 pPICZαA质粒与kerC基因的连接
• 3.1.4 大肠杆菌DH5α中重组表达载体pPICZαA-kerC阳性转化子的筛选
• 3.2 重组表达载体pPICZαA-kerC的转化和毕赤酵母X-33阳性转化子的筛选
• 3.3 重组菌株P.X.KC-9的诱导表达
• 3.4 重组菌株的遗传稳定性分析
• 3.5 P.X.KC-9表达的角蛋白酶的酶学性质分析
• 3.5.1 重组角蛋白酶最适反应温度的测定
• 3.5.2 重组角蛋白酶热稳定性的测定
• 3.5.3 重组角蛋白酶最适反应pH的测定
• 3.5.4 重组角蛋白酶pH稳定性的测定
• 3.5.5 金属离子对重组角蛋白酶的影响
• 3.6 重组角蛋白酶的SDS-PAGE分析
• 4 讨论
• 4.1 角蛋白酶酶基因的克隆及表达
• 4.2 重组菌株的筛选及其诱导表达
• 4.3 重组角蛋白酶的酶学性质分析
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢