论文摘要
背景:BCR/ABL可组成性激活多种不同的信号途径,形成了一个非常复杂的网络系统,在很大程度上,这些信号最终传递至细胞核内并调控凋亡和生存相关基因的表达,从而延缓白血病细胞的凋亡,促进细胞存活,维持恶性细胞和克隆在体内长期存活和聚积。Survivin是一个凋亡抑制因子家族（IAP）成员,在肿瘤的形成过程中发挥着多重效应,是肿瘤细胞凋亡和分裂的界面分子,并参与基因组复制检测点的监测和肿瘤的血管新生,因而成为肿瘤治疗的一个理想靶点。最近,有研究表明BCR/ABL能够激活Survivin的表达,并提示survivin可能是CML发展过程中一个重要的分子。然而,关于survivin在CML细胞中的具体调控机制和生物学作用还不清楚。目的:以BCR/ABL转化的造血细胞系为研究模型,系统探讨survivin表达调控的信号途径和分子机理,以及这一信号网络在BCR/ABL介导的细胞恶性转化和抗凋亡调控中的作用,与此同时寻找其中关键分子作为靶点,观察其在抗白血病治疗中的效应。方法:半定量PCR、Western blot、免疫荧光、流式细胞仪技术比较BCR/ABL转化细胞和对照细胞中survivin的表达和细胞内定位。克隆和构建survivin启动子与萤光素酶基因融合的报告载体,使用缺失突变和定点突变的方法鉴定survivin启动子上BCR/ABL相关的作用元件。凝胶电泳迁移试验（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）技术分别在体外和活细胞水平上证实c-Myc与survivin启动子的结合作用。Western blot分析CML细胞中c-Myc和survivin表达的相关性。应用MAPK、PI3K、JAK2的特异性阻断剂进一步阐明c-Myc介导的survivin表达的相关信号途径。采用逆转录病毒介导的基因转移和表达技术以及shRNA干扰技术,阐明c-Myc和survivin在BCR/ABL介导的细胞转化和抗凋亡中的作用。最后,应用c-Myc特异性阻断剂——10058一F4,观察其单独应用和联合伊马替尼对CML细胞的凋亡诱导效应,以及对BCR/ABL激酶依赖和非依赖的伊马替尼耐药的逆转作用。结果:BCR/ABL转化的细胞系中survivin表达显著升高,伊马替尼能够抑制其表达并主要影响其在细胞浆的分布。BCR/ABL对survivin表达的调控不依赖于细胞周期和mRNA的稳定性,主要作用于其转录水平上。BCR/ABL通过JAK2和PI3K交联的信号途径激活c-Myc的表达和活性,后者与survivin启动子上的E-box元件结合,从而增强survivin在CML细胞中的表达。并且survivin与c-Myc的表达呈一定的相关性。Survivin表达与伊马替尼诱导的细胞凋亡之间存在着动力学的关系,其表达下调是CML细胞凋亡的一个早期事件,survivin过表达能部分抵抗伊马替尼和去除细胞因子引起的细胞凋亡效应。shRNA干扰c-Myc和survivin表达显著抑制K562细胞在甲基纤维素半固体培养基中的克隆形成能力。10058-F4抑制c-Myc活性并能够诱导细胞凋亡,具有与伊马替尼协同效应。此外,细胞因子IL-3能以BCR/ABL激酶非依赖的机制诱导CML细胞对伊马替尼的耐受,而10058-F4能够抵抗IL-3的抗凋亡作用。同时,10058-F4还能增强BCR/ABL依赖的耐药细胞K562/G01对伊马替尼的敏感性。结论:JAK2/PI3K介导和c-Myc依赖的survivin表达是BCR/ABL下游分子信号网络的一条新的转录调控途径,并参与对细胞转化和凋亡的调节,抑制此通路中的关键分子节点可作为慢性髓细胞白血病治疗的一种新策略。
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