糖原合酶激酶-3促进成年大鼠海马的神经发生及其机制的探讨

论文摘要

神经发生在成年哺乳动物脑内仍然持续存在,并主要局限于海马齿状回的亚颗粒层（ Subgranular zone, SGZ）和前脑的室管膜下区（Subventricular zone, SVZ）两个脑区。阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老年人常见的一种慢性进行性神经退行性疾病,其患者脑内海马区神经发生的水平明显高于正常人,目前对此现象产生的机制仍不清楚。目前针对AD尚无有效的治疗措施,刺激患者脑内新生神经元的产生增多使其替代衰老、死亡的神经元发挥正常功能成为目前极具前景的一个治疗靶点。因此,了解AD患者脑内影响神经发生的相关因素,弄清其脑内神经发生水平增高的原因具有重要的意义。以过度磷酸化的微管相关蛋白tau为主要成分的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）是AD患者脑内主要的病理特征之一,糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3, GSK-3β）是导致tau蛋白过度磷酸化的关键激酶,与AD病变的发展具有密切的联系。此外,tau蛋白与GSK-3β在神经元的发育中也具有重要作用。本研究旨在通过观察GSK-3β活性增高对成年大鼠脑内神经发生的影响及磷酸化tau蛋白在SGZ区和SVZ区与新生神经元之间的关系,探讨AD患者脑内神经发生水平增高的可能机制。为探讨GSK-3β与成年神经发生的关系,我们首先采用免疫荧光双标的技术对成年大鼠脑内SGZ区和SVZ区GSK-3β与未成熟神经元之间的关系进行了观察;接下来,为观察GSK-3β活性增高对成年神经发生的影响,我们将动物分为2组,通过侧脑室定位注射生理盐水（NS组）或PI3K特异性抑制剂wortmannin（WT组）,并分别于术后不同时间点取材,采用免疫组化的方法对大鼠脑内神经发生的水平进行测定;为进一步明确GSK-3β对成年神经发生的作用,我们将动物分为5组,通过侧脑室注射分别给予10μl的NS、10μMWT、100μMWT、70μM的GSK-3β特异性抑制剂SB216763 （ SB ）或100μMWT和70μM SB联合给药,术后3天取材,采用免疫印迹的方法对大鼠脑内神经发生的水平进行测定;为探讨GSK-3β活性增高对成年大鼠齿状回内细胞增殖、分化及存活的影响,我们在侧脑室给药前对大鼠进行连续3天的BrdU腹腔注射,标记此时处于增殖期的新生细胞,并于术后跟踪观察BrdU+细胞的数量改变及分化情况。结果显示:1. GSK-3β广泛分布于成年大鼠海马齿状回及前脑的室管膜下区,与新生神经元存在明显的共定位关系,但其非活性形式pS9-GSK-3β不表达于新生神经元内;2.脑内GSK-3活性增高可特异性地引起成年大鼠海马齿状回的神经发生水平增高;3. GSK-3主要通过促进细胞增殖使大鼠海马齿状回的新生神经元增多。为观察tau蛋白的磷酸化水平与神经发生之间的相关性,我们采用免疫印迹的方法对WT处理的大鼠脑内tau蛋白的磷酸化水平进行了测定;接下来,为探讨磷酸化tau蛋白与神经元发育之间的关系,我们选取了出生1天（P1）、出生8天（P8）、1月龄（P30）及成年大鼠（Adult,3-4月龄）4个年龄段的大鼠脑片用于研究,分别用识别未成熟神经元的抗体DCX和NeuroD,识别磷酸化tau蛋白的抗体PS396, PT205和PT231以及识别非磷酸化tau蛋白的抗体tau-1对大鼠脑内齿状回和SVZ区未成熟神经元及tau蛋白的分布/表达随年龄增长的变化情况进行观察;最后,为明确成年大鼠脑内磷酸化/非磷酸化tau蛋白与未成熟神经元之间的关系,我们采用免疫荧光双标的方法对大鼠脑内齿状回和SVZ区tau蛋白与未成熟神经元的关系进行了观察。结果显示:1.通过侧脑室注射WT使脑内GSK-3活性增高,可使大鼠齿状回tau蛋白的磷酸化程度明显增高;2.齿状回内DCX和NeuroD阳性细胞的分布与tau蛋白的表达均随着年龄的增长而明显减少,磷酸化tau蛋白的分布/表达与新生神经元之间存在明显的相关性;SVZ区内DCX的分布范围随年龄增长逐渐减小,但其表达强度和tau蛋白一起随着年龄的增长逐渐增加,并在成年后维持一定的强度;3.成年大鼠脑内磷酸化tau蛋白与新生神经元之间存在明显的共定位关系。我们的结果提示,GSK-3的活性增高可使成年动物海马区的神经发生水平明显增加,而磷酸化tau蛋白特异性地表达于未成熟神经元内,在新生神经元的发育中具有一定的作用。本研究为揭示AD患者脑内神经发生水平增高的机制提供了实验证据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 创新点
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 附录1
• 附录2